观察SK通道在AF早期阶段心房肌细胞中的功能变化 心房颤动(AF)是临床常见病，心房重构是其重要病理生理基础。小电导钙激活钾(SK)通道是钙激活钾通道家族成员，包括3种亚型(SK13)，是介导细胞内Ca2+调控与细胞膜电活动的重要离子通道。近年来发现，SK通道呈“心房选择性”分布，且与AF发生密切相关。本课题组前期工作首次证实，慢性AF患者心房肌细胞SK1、SK2亚型下调。但在AF早期阶段，SK通道功能如何变化却存在争议。本研究观察SK通道在AF早期阶段心房肌细胞中的功能变化并探讨其意义。1、材料与方法11动物与分组成年雄性比格犬8只，体质量1315kg。分为快速心房起搏组5只与对照组3只。12方法121快速心房起搏犬模型的制备快速心房起搏组犬置于无菌环境、全麻状态下(氯胺酮50mg/kg+地西泮02mg/kg，静脉注射;15%异氟醚吸入)，气管插管后机械通气(潮气量10mL/kg，频率20次/min)，于胸骨右缘第5肋间开胸，暴露心脏将起搏电极缝合在右心耳部，起搏器(华南理工大学电子研究所制作，输出电压4V，脉宽05ms)频率调至400次/min，持续起搏4h。对照组手术方法相同，但不进行起搏。122膜片钳全细胞记录1221心房肌细胞分离采用自制改良的Lan-gendorff灌流法和自制的冠脉插管装置。分离后的左心房肌细胞保存在改良KB液中，室温下静置孵育6h后进行实验。1222全细胞钙激活钾电流(IK，Ca)记录选取纹理清晰、杆状和大小适中的细胞在24条件下进行实验。将适量细胞(约15mL)放于倒置显微镜(OL-PUSIX70型，日本)的细胞池中，贴壁8min后，开始实验，灌流速度约15mL/min。在电极拉制仪(Nar-ishigePP830型，日本)分两部拉制电极，灌电极液后电阻为24M，并置于推进器上，通过三维操纵器(Narishige，日本)驱动电极，并轻压在细胞表面。用负压使电极与细胞表面形成高阻封接后，用ZAP或给负压破膜，给予电容及串联电阻补偿，形成全细胞记录。电流信号经Ag/AgCl电极引导，由膜片钳AX-ON200B放大器放大通过AD/DA转换板(AXONDigiDatal200，美国)，存储于计算机硬盘中。实验过程由pClAMP90软件程序(AXON，美国)刺激发放和信号采集。采用pCLAMP90软件对单个全细胞记录进行数据和图形转换，Prism30软件对数据进行曲线拟合及绘制离子通道电流密度电压(-)曲线。根据文献，本研究中将电极内液的游离Ca2+浓度设定为1000nmol/L，以最大限度地保证SK通道激活。形成全细胞封接状态后，将细胞钳制在55mV，给予指令电位从100mV+80mV，步长20mV，波宽为500ms的刺激。记录用药前电流后，用含SK通道特异性阻断剂蜂毒明肽(100nmol/L)的电极外液灌流3min，再次记录电流，给蜂毒明肽前后的电流相减获得“蜂毒明肽敏感性电流”，此电流即“IK，Ca”。记录每个细胞电容，计算电流密度(pA/pF)=电流(pA)/电容(pF)。123统计学方法采用SPSS130统计学软件。数据以珋xs表示，组间数据比较采用Studentst检验。P005为差异有统计学意义。2、结果全部犬顺利完成实验，每只犬至少取3个心房肌细胞进行膜片钳实验。当钳制电位为100mV时，快速心房起搏组心房肌细胞电流密度为(1703)pA/pF，对照组为(0701)pA/pF，P001;+80mV时，快速心房起搏组心房肌细胞电流密度为(4106)pA/pF，对照组为(1602)pA/pF，P001。3、讨论SK通道家族的特性是电压非依赖性、仅由细胞内的Ca2+激活和可被蜂毒明肽特异性阻断，蜂毒明肽对SK通道有高度选择性，对其他离子通道则不敏感。SK通道是细胞内的钙调控和细胞膜的电活动之间的重要功能链接。AF的发生、发展与离子通道表达异常和细胞内的钙调控失常密切相关。Li等发现，SK2基因敲除小鼠的心肌细胞动作电位延长，更易于诱发AF。Ellinor等发现，人类1q21位点的KCNN3(SK3)基因多态性与孤立性AF的发生相关。最近3项动物实验结果显示，阻断SK通道可以中止AF的发作，提示SK通道可能是一种新型的AF相关性离子通道。Tuteja等和Xu等的研究证实，SK1和SK2通道呈“心房选择性”分布。该特性使SK通道极有可能成为新的“选择性”治疗AF的药物靶点，即特异性阻断SK通道的药物可以有效治疗或预防AF，且无其他抗心律失常药物常见的致室性心律失常的风险。我们的前期实验已经证实，慢性AF(AF维持阶段)患者心房肌细胞中IK，Ca电流密度减低、SK1和SK2表达下调。但Nagy等报道，在生理状态下，大鼠、犬和人心室肌细胞的SK2通道处于失活状态，对动作电位的复极化过程不产生影响。Ozgen等的研究显示，短时间(3h)快速起搏(模拟AF早期阶段)可使兔肺静脉肌袖细胞IK，Ca电流密度增强，SK2亚型表达增加，但该研究是在离体组织模型上进行的。本研究采用活体犬AF模型，结果显示IK，Ca电流密度在AF早期阶段增强。该结果与Nagy等的研究结果吻合。这说明SK通道在AF的不同时期功能变化不同，即SK通道在AF初始(早期)阶段和维持阶段(慢性AF)呈“矛盾性重构”改变。综上所述，SK通道的功能上调是AF初始阶段的重要分子机制之一。由此推测，未来开发新型的特异性SK通道阻断剂，并预防性应用于AF高危人群中，可能大大降低AF的发生率。-全文完-