1杠板归提取物抗单纯疱疹病毒-I 型的药理作用研究作者：张长城,黄鹤飞 周志勇，袁丁【摘要 】 目的研究杠板归提取物体外抗单纯疱疹病毒-1( HSV-1)的作用，探讨杠板归抗疱疹病毒的药理作用与有效部位。方法利用溶剂法和色谱法从杠板归中提取分离出 4 个部位， MTT 法检测杠板归各提取物的病毒抑制效果，以病毒抑制率和治疗指数(TI)为评价指标，比较各部位体外抗病毒的效果。结果杠板归醇提部位与大孔树脂醇洗部位抗病毒作用最强，药物浓度在 8 gml-1 以上时，对HSV 的抑制程度可达 50%以上，与阳性对照药阿昔洛韦无统计学差异(P0.05)。结论杠板归提取物体外具有较好的抗 HSV-1 作用，其有效成分为黄酮类化合物，具有进一步研究开发价值。 【关键词】 杠板归; 单纯疱疹病毒-1; 有效部位杠板归系为蓼科蓼属 Polygonaceae 植物杠板归 Polygonum perfoliatum L.的新鲜或干燥全草，又名贯叶蓼，具有清热解毒、祛痰止咳、利湿消肿、散瘀止血等功效，主治痈肿疔疮、丹毒等，始载于万病回春 。民间习用杠板归鲜品或干品捣烂外敷治疗带状疱疹等疾病，具有良好的效果。现代药理研究表明，杠板归具有抗炎、抑菌、抗肿瘤等活性1，2。目前对杠板归抗病毒活性的研究较少，2其药理活性部分与活性成分尚不明确。本文通过研究杠板归各提取部位体外抗 HSV-1 活性研究，探讨杠板归抗疱疹病毒活性的主要活性部位与可能活性成分。1 材料与仪器1.1 药物杠板归鲜品采自湖北宜昌市，经三峡大学医学院中药学教研究室谭复成教授鉴定。阳性对照药物：阿昔洛韦(ACV,上海通用药业股份有限公司)。1.2 试剂与仪器 MTT(4，5 二甲基噻唑-2，5-二苯基四唑溴化物)为 SIGMA 公司产品;RPMI 1640 培养基为 GIBICO 公司产品;二甲基亚砜(DMSO)购自上海菲达有限公司;小牛血清购自三利公司;所用化学试剂均为国产分析纯。超净工作台(美国 Forma 公司);TGL-16C 型高速台式离心机( 上海安亭科学仪器厂);DG3022-A 型酶联免疫检测仪(国营华东电子管厂) 。1.3 细胞与病毒 Hep-2 细胞为武汉大学典型培养物保藏中心提供。细胞生长液为 RPMI-1640，加 10%小牛血清，100 U/ml 青霉素，100 g/ml 链霉素。细胞维持液中加 2%新生小牛血清。单纯疱疹病毒型(HSV-1)SM44 株，武汉大学医学院病毒学研究所提供，经 Hep-2 细胞活化增殖，CPE 达 75%以上(+)3收获，测定病毒滴度为 TCID5010-5.6/0.1 ml，分装后于-80冻存备用，实验用病毒浓度为 1 000 TCID50。2 方法2.1 供试品的制备取杠板归干燥药材 50g，用石油醚脱脂后，用 20 倍量 75%乙醇微沸回流提取 2 次，每次 2 h，提取液减压浓缩、干燥，得醇提物(干燥后得醇提部位);醇提物加水溶解，通过D101 大孔树脂，水洗后经 75%乙醇溶液洗脱，得到水洗部位及醇洗部位;经乙醇提取后的药渣用水回流提取两次，每次 2 h，减压浓缩、干燥得水提部位。以芦丁(购于中国药品生物制品检定所)为标准对照品，采用硝酸铝络合分光光度法3测得经大孔树脂纯化后的母液总黄酮含量达 86.08%。过滤除菌分装，实验前用含 2%的小牛血清的 1640 培养基稀释到所需浓度。2.2 药物对细胞的毒性作用用胰酶将生长良好的 Hep-2 细胞消化分散成单个细胞悬液，按 2105/ml 的浓度每孔 100 l 接种于 96 孔板。置 37，5%CO2 培养箱中培养 24 h。待细胞长成单层后，弃培养液上清，换成不同浓度的含药维持液，每孔 200 l，每种浓度重复 4 孔。同时设 4 个组，分别为空白细胞对照、病毒感染对照、ACV 阳性对照、受试药物组，继续培养并于倒置显微镜下每日观察记录。采用 MTT 法4检测细胞存活率：上述药物作用的4细胞继续培养 72 h，弃培养液上清，每孔加入含 5 mg/ml MTT 的无血清 RPMI-1640 培养基 50 l，置 CO2 培养箱中继续培养 23 h 后，弃 MTT 上清，PBS 洗 3 次，每孔加溶解液(DMSO 乙醇体积比为 11)100 l，振荡 510 min，待结晶完全溶解，置酶标测定仪上，测定 570 nm 波长处的光密度 OD 值，计算细胞存活率。实验重复 3 次。2.3 药物抗病毒实验于已长成单层 Hep-2 细胞 96 孔板上，每孔接种 100 l 的 1 000 TCID50/0.1 ml 的 HSV-1 病毒液，于37吸附 2 h，弃病毒上清并用 PBS 洗涤。根据细胞毒性实验的结果，在无细胞毒性浓度范围内，加入不同浓度的含药维持液每孔200 l，每种浓度重复 4 孔。然后将 HSV 培养板置 37 、5%CO2培养，逐日观察细胞病变情况。当病毒对照 CPE 达“+ +”时，用 MTT 检测病毒抑制率。实验重复 3 次5，6 。2.4 统计学方法 用统计软件 SPSS11.5 的 Probit 回归法计算药物半数毒性浓度 TC50 和半数抑制浓度 IC50，得到药物治疗指数(Treatment Index, TI=TC50/IC50)。3 结果3.1 药物对细胞的毒性作用药物对 Hep-1 细胞毒性作用表现为: 细胞粘连、变圆、壁厚、破碎脱落, 胞质内颗粒增加,折光性增强5并且吸光值明显下降。随着药物的浓度增加细胞存活率呈递减趋势。结果见表 1。表 1 各提取物对 Hep-2 细胞的毒性作用3.2 杠板归各部位抗病毒活性杠板归醇提部位、醇洗部位提取物、杠板归总提物抗 HSV-1 作用显著，最高抑制率可达78.10%，杠板归水洗部位及水提部位效果均较差，醇提部位、醇洗部位提取物之间没有明显的差异，与阳性对照药物对 HSV 的抑制作用无统计学差异(P0.05) ，结果比较见表 23。表 2 各提取物对HSV-1 病毒生物合成作用表 3 4 个提取部位的药效学指标比较4 讨论临床常用的抗单纯疱疹病毒药物有阿昔洛韦、喷西洛韦等核苷类抗病毒药物，其作用途径主要是抑制病毒复制过程中重要酶的活性，阻止病毒复制和侵染宿主细胞。但核苷类药物都存在一些缺陷，如生物利用度低，溶解度小，并在体内迅速失效及潜在致畸等副作用，长期服用可产生耐药性7，8。杠板归为民间草药，具有一定的抗炎、抑菌作用，民间常用于治疗疱疹病毒感染。本实验初步讨论了杠板归抗 HSV-1 病毒的有效成分，实验结果表明：杠板归醇提部位与杠板归醇洗脱部位有显著抗 HSV-1 作用，效果与 ACV 相当。杠板归经 D101 大孔树脂 75%醇6洗脱后母液中黄酮含量达 80%以上，提示杠板归中抗 HSV-1 的主要有效成分为黄酮类化合物。但杠板归提取物如何进入细胞，通过何种机制阻断病毒感染细胞并抑制病毒的复制,尚有待进一步研究。杠板归资源丰富，本实验为杠板归的进一步开发利用提供了实验基础。【参考文献】1 章永红.抗癌中药大全M.南京：江苏科学技术出版社,2000：217.2 黄鹤飞,张长城,袁 丁,等. 杠板归抗炎抑菌活性部位研究 J.安徽医药,2008,7 (12):595.3 国家药典委员会. 中国药典 S.北京:化学工业出版社,2005：247.4 傅继华.病毒学实用实验技术M.济南: 山东科学技术出版社,2001:271.5 肖春惠,杨占秋,肖 红,等.喷昔洛韦体外抗疱疹病毒活性的研究J.中国病毒学,2002,17(2):102.76 魏金亮，许 珍，王 璐，等. 荔枝核黄酮体外抗单纯疱疹病毒的作用J.武汉大学学报 (医学版)，2009，30(1)：89.7 Erard V , Wald A , Corey L , et al. Use of long-term suppressive acyclovir after hematopoietic stem-cell transplantation : Impact on herpes simplex virus ( HSV) disease and drug-resistant HSV diseaseJ.Journal of Infectious Disease ,2007 ,196 (2) : 266.8 Suzuki M , Okuda T , Shiraki K. Synergistic antiviral activity of acyclovir and vidarabine against herpes simplex virus types 1 and 2 and varicella-zoster virus J.Antiviral Reseach , 2006 ,72 (2) : 157.