1CFSE 标记抗原特异性 CD4+CD25+T 细胞在胰岛移植体内归巢的研究作者：张梅,徐书杭, 徐瑜,刘翠萍, 茅晓东,徐宽枫,刘超【摘要 】 目的 : 观察抗原特异性 CD4+CD25+Treg 细胞在小鼠同种异体胰岛移植后体内的分布特点, 探讨抗原特异性CD4+CD25+Treg 细胞免疫调节可能机制。方法:构建小鼠同种异体胰岛移植模型。CFSE 对抗原特异性 CD4+CD25+Treg 细胞标记, 经尾静脉输注。用组织冰冻切片和流式细胞术动态了解 CFSE 标记的抗原特异性 CD4+CD25+Treg 细胞在受体内的分布和增殖变化。结果: 抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞联合胰岛移植组胰岛移植物平均生存期为(34.5717.15) d, 较胰岛移植组生存时间(10.61.82) d, 差异有统计学意义(P0.01)。抗原特异性CD4+CD25+ Treg 细胞在各级淋巴结均有能定居, 但是胰腺淋巴结定居的细胞数量明显多于其他淋巴结。结论:抗原特异性 Treg细胞抑制 STZ 诱导的糖尿病小鼠的急性移植排斥反应, 细胞抑制功能与细胞在体内淋巴结的归巢有关。AIM: To observe the distribution and proliferation of the antigenspecific CD4+CD25+ regulatory T (Treg ) cells and investigate the potential mechanism of antigenspecific CD4+CD25+ regulatory T cells on the suppression of 2rejection for allogenetic islet transplantation in vivo. METHODS: Antigenspecific CD4+CD25+ Treg cells were generated by the addition of multiple intravenous injections of ICR mice splenocytes in vivo. After labeled by CFSE, 8105 antigenspecific Treg cells were injected via tail vein with islets transplantation. Homing and distribution of antigenspecific CD4+CD25+ Treg cells were investigated by flow cytometric analysis and immunofluorescence. RESULTS: In vivo, the mean survival time of recipients with islets and antigenspecific CD4+CD25+ Treg cells were (34.5717.15) days, whereas transplanted islets without Treg treatment survived (10.61.82) days in control mice. The transferred antigenspecific CD4+CD25+ Treg cells were mainly resident in pancreatic node and mesenteric node. CONCLUSION: Allogeneic antigenspecific CD4+CD25+ Treg cells prolong islet graft survival, and draining lymphoid tissue play a key role in the immune response. 【关键词】 CD4+CD25+调节性 T 细胞; 胰岛/ 移植; CFSE胰岛移植是治疗 1 型糖尿病理想的方法。近年来, 较多研究发现 CD4+CD25+调节性 T 细胞(regulatory T cell, Treg)在调节移3植免疫中起重要作用1 。Treg 细胞主动免疫调节作用为移植排斥反应的治疗开辟了一条新途径。选择合适的细胞标记物跟踪观察, 对于研究移植后的细胞在体内作用机制具有重要作用。在构建小鼠胰岛移植模型的基础上, 我们将标记荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5, 6carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE) 抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞回输至体内, 以观察细胞在体内的生物学特性, 从而对抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞在同种异体胰岛移植排斥反应的调控机制进行初步研究。1 材料和方法1.1 材料 清洁级 ICR 小鼠(雌雄不拘, 体质量 2535 g) 购自江苏省实验动物中心; 清洁级 BALB/c ByJ 小鼠(雄性, 体质量2528 g) 购自南京大学模式动物中心(ICR 和 BALB/cByJ 小鼠分别作为移植的供体和受体。无特殊病原菌饲养级饲养)。链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)和型胶原酶购自 Sigma 公司; 小牛血清购自 Hyclone 公司; RPMI1640 培养液购自 Gibco 公司; Histopaque分离液购自 Pharmacia 公司; 胰岛素 ELISA 试剂盒购自 Linco 公司; PECy5antiCD3、 PEantiCD4 和 FITCantiCD25 抗体均购自 Caltag 公司; 小鼠 CD4+CD25+T 细胞磁珠分离试剂盒购自Miltenyi Biotec 公司; CFSE 购自 Fluka 公司 ; XYH2A 体视显微镜购自上海光学仪器公司; 优越型血糖仪购自 Roche 公司; 4BIORAD2100 型激光共聚焦显微镜购自 BioRad 公司; FACSCalibur 流式细胞仪购自 Becton Dickinson 公司。1.2 方法1.2.1 实验设计 STZ 诱导糖尿病 BALB/cByJ 小鼠为受体; ICR 小鼠为供体; 实验分为 3 组: A 组: 糖尿病 BALB/cByJ 小鼠对照组(n=5); B 组: 糖尿病 BALB/cByJ 小鼠胰岛移植组(n=5); C 组: 糖尿病 BALB/cByJ 小鼠胰岛移植联合抗原特异性 CD4+CD25+ T 细胞组(n=7)。在胰岛移植前经尾静脉回输 8105 个抗原特异性CD4+CD25+ T 细胞。正常对照组(n=5) 。1.2.2 抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞制备 取制备好的ICR 小鼠单个核细胞悬液, 加入 MMC(25 mg/L)37孵育 30 min, PBS 洗涤 2 次, 1 200 r/min, 离心 5 min, 重悬于 PBS 液, 调整细胞密度 21010/L, 分别免疫 BALB/cByJ 小鼠 0.5 mL/次, 尾静脉注射, 每周 1 次, 连续 3 周。于第 3 次免疫后第 5 天, 分别取出被免疫的 BALB/cByJ 小鼠的脾脏制备淋巴细胞悬液。MACS 法分离CD4+CD25+ Treg 细胞2 。1.2.3 小鼠胰岛分离 ICR 小鼠, 非禁食 , 10 g/L 戊巴比妥麻醉后手术区消毒, 腹部 V 字型切口, 结扎近十二指肠端胆总管, 靠肝5门近端逆行插入 26G 静脉注射针。破心放血处死动物。将冷胶原酶溶液从插管处灌注 4 mL, 迅速完整的摘取胰腺放入含 1 mL 冷胶原酶试管中, 于 37水浴静止消化 1215 min, 在涡流震荡器上震荡10 s, 呈细沙状 , 然后放置冰上 , 立即加入含 100 mL/L 小牛血清的4 Hank 液, 终止消化。 30 目不锈钢细胞筛过滤, 去除淋巴结等组织。1 000 r/min, 离心 2 min, 弃上清, Hank 液洗涤 2 遍。1.2.4 糖尿病小鼠模型的制备 BALB/c 小鼠, 禁食 12 h, 用柠檬酸 柠檬酸钠溶液(pH4.5) 溶解 STZ。按 200 mg/kg 体质量单剂量腹腔注射, 4872 h 后尾静脉采血, 全血血糖16.7mmol/L, 且出现明显清瘦、 多食、 多饮、 多尿, 且维持 1 周以上者确定为糖尿病模型建立。1.2.5 同种异体胰岛移植 10 g/L 戊巴比妥腹腔麻醉, 暴露左肾, 从肾下极沿包膜下间隙游离至上极, 注射分离的新鲜胰岛（500 600 个）, 缝合。糖尿病对照组肾包膜下注射 30 L 生理盐水。移植后第 1 周每日测量血糖 , 自第 2 周起每周测量 2 次血糖。以非禁食血糖11.1 mmol/L 判定为移植物存活, 移植有效。连续 2 次血糖11.1 mmol/L 为移植物排斥, 以出现第 1 次升高的时间为排斥时间。1.2.6 CFSE 标记抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞并回输 6用 PBS 液调整抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞悬液的密度为1109/L。加入等体积的 CFSE 工作液。充分混匀, 37孵育 10 min。PBS 洗涤细胞 2 次, 1 500 r/min, 离心 5 min, 弃上清。重新悬浮细胞于 PBS 液, 并调整细胞密度为 1109/L 。将 CFSE 标记的抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞, 经尾静脉注射到受体体内。1.2.7 抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞示踪检测 分别于细胞输注后不同时间点处死取小鼠, 将每组小鼠(n=2)以颈椎脱臼法处死并放血。取小鼠淋巴结、 脾脏, 切除小部分留作组织学检查荧光标记细胞分布, 其余留作流式细胞术 (FCM)检查。所有动物不计入生存期观察。1.2.8 抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞体内增殖的检测 制备淋巴细胞悬液, 将分离的受体淋巴细胞重新悬浮于 200 L 的PBS 液。加 2.5 L PEantiCD25 抗体, 4, 避光孵育 30 min。PBS 洗 2 次, 1 200 r/min, 离心 5 min。0.5 mL PBS 重悬细胞。流式细胞仪检测。以未进行 CFSE 标记的细胞为阴性对照 , 以CFSE 标记的回输前细胞为阳性对照。1.2.9 抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞体内分布的组织学检测 将获取肠系膜、 腹股沟和胰腺的淋巴结迅速放置于 OCT 包埋剂中, 行冰冻切片术, 切片 5 m 厚。在共聚焦显微镜下观察。同7时取正常小鼠淋巴结组织做阴性对照。1.2.10 统计学分析 实验数据以 xs 表示。使用 SPSS10.0软件分析, 2 组间比较采用 t 检验, 存活率用 KaplanMeier 分析。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 抗原特异性 CD4+CD25+Treg 细胞延长胰岛移植物存活时间 抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞明显延长胰岛移植物存活时间。7 只接受 8105 个抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞联合胰岛移植的糖尿病小鼠全部在 24 h 内恢复正常的血糖(10 mmo1/L), 实现了胰岛素的不依赖性。抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞联合胰岛移植组胰岛移植物平均生存期为(34.5717.15) d, 较胰岛移植组生存时间(10.61.82) d, P0.01 为差异有统计学意义。2.2 抗原特异性 CD4+CD25