结核菌素纯蛋白衍生物Jiehejunsu Chundanbai YanshengwuPurified Protein Derivative of Tuberculin (TB－PPD)本品系用结核分枝杆菌经培养、杀菌、过滤除去菌体后纯化制成的 纯蛋白衍生物 ，用于结核病的临床诊断、卡介苗接种对象的选择及卡介苗接种后机体免疫反应的监测。1 基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。结核菌素纯蛋白衍生物（TB-PPD）生产车间必须符合国家生物安全防护等级的要求，必须与其他生物制品生产车间及实验室分开, 原液生产全部过程，包括结核分枝杆菌的灭活，应在完全隔离的区域内进行, 所需设备及器具均须单独设置并专用。直接用于生产的金属或玻璃等器具，应经过严格清洗及灭菌处理。从事 TB-PPD 生产的工作人员必须身体健康，经 X 射线检查无结核病，且每年经 X 射线检查 1～2 次，可疑者应暂离该制品的制造。2 制造2.1 菌种生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。2.1.1 名称及来源采用人型结核分枝杆菌 CMCC 93009（H37Rv）菌株。2.1.2 种子批的建立应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。2.1.3 种子批的传代自工作种子批至菌体收集传代应不超过 12 代。2.1.4 种子批菌种的检定2.1.4.1 染色镜检菌体染色后镜检为短粗杆菌、微弯曲两端圆、抗酸染色阳性。2.1.4.2 生化反应硝酸盐还原、 烟酸反应、 尿素酶应为阳性，耐热触酶、聚山梨酯 80 水解应为阴性（附录ⅩⅣ） 。2.1.5 种子批的保存冻干菌种保存于 8℃ 以下 ，液体菌种保存于-70℃以下。2.2 原液2.2.1 生产用种子取工作种子批菌种在苏通马铃薯培养基或改良苏通综合培养基 或其它适宜培养基 中传代培养，以作为生产用种子。2.2.2 培养基采用苏通马铃薯培养基、改良苏通综合培养基或经批准的其他培养基。2.2.3 菌种接种和培养启开菌种后接种于苏通马铃薯培养基，置 37℃培养 2～3 周，可在苏通马铃薯培养基上再传 1 代或直接挑取生长良好的菌膜，将生产用菌种移种于改良苏通综合培养基或其他适宜培养基的表面，置 37℃静置培养 1～2 周，挑取发育良好的菌膜移种于改良苏通综合培养基或其他培养基的表面，置 37℃静置培养 8～10 周。凡在培养期间或培养终止时，有菌膜下沉、发育异常或污染杂菌者，应废弃。2.2.4 收获及杀菌培养终止，将培养物于 121℃30 分钟杀菌后，过滤除去菌膜及菌体。如滤液需保存，应加入 3.0g/L 苯酚或其他适宜的防腐剂，于 4～8℃保存，保存期不超过 30 天。2.2.5 纯化收集滤液进行纯化。用三氯乙酸和饱和硫酸铵法分别沉淀蛋白质，采用经批准的方法纯化，除菌过滤后即为原液。2.2.6 合并及冻干2.2.6.1 合并将不超过 5 次纯化的原液进行合并。2.2.6.2 分装及冻干原液检定合格后，可根据蛋白质含量将原液稀释至规定浓度，定量分装，分装后立即冻干。2.2.7 原液检定按 3.1 项进行。2.2.8 保存及有效期原液应于 2～8℃保存。液体原液自效价测定合格之日起有效期为 5 年；冻干品自效价测定合格之日起，每隔 5 年应按 2.1 项进行检定，合格后可继续使用。2.3 半成品2.3.1 配制经检定合格的原液，用 0.01mol/L PBS（pH7.2～7.4 含 0.0005%聚山梨酯 80 及 3.0g/L苯酚）稀释至 20IU/ml 或 50IU/ml。 稀释时充分摇匀，并逐瓶做无菌检查（附录 Ⅻ A）2.3.2 半成品检定按 3.2 项进行。2.4 成品2.4.1 分批应符合“生物制品分批规程”规定。2.42 分装应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。2.43 规格每瓶 1ml、2ml。每 1 次人用剂量为 0.1ml，含 TB-PPD 5IU、2IU。2.4.4 包装应符合“生物制品包装规程”规定。3 检定3.1 原液检定3.1.1 外观原液冻干品应为白色疏松体。液体原液及冻干品复溶后应呈棕黄色澄明液体，无不溶物或杂质。3.1.2 复溶时间冻干品按标示量加入注射用水后，应于 3 分钟内完全溶解。3.1.3 水分应不高于 3.0%（附录Ⅶ D） 。3.1.4 纯度3.1.4.1 蛋白质含量依法测定(附录Ⅵ B 第二法 )。3.1.4.2 多糖与核酸含量每 1mg 蛋白质含多糖与核酸总量应不高于 0.1mg。（1）多糖含量测定：以生理氯化钠溶液稀释无水葡萄糖标准品，制备 0～100μg/ml葡萄糖标准溶液。将硫酸 225ml 加入到 75ml 生理氯化钠溶液中，另称取蒽酮 0.6g 加入10ml 乙醇中，将上述溶液混合，配制成蒽酮混合液。分别精确量取 1.0ml 不同浓度标准葡萄糖溶液以及本品，加入 4.0ml 蒽酮混合液，混匀，置沸水浴 20 分钟后于波长 620nm 处测定吸光度，以葡萄糖标准溶液浓度对应其吸光度，用 minitab 或其他统计学方法求回归方程，代入本品吸光度，计算多糖含量。（2）核酸含量测定：取本品 2～3ml，采用紫外－可见分光光度法（附录Ⅱ A） ，于波长 260nm 处测定吸光度，按 E1% 1cm=200 计算核酸含量。3.1.5 效价测定3.1.5.1 动物法将标准品及本品分别稀释 3 个不同稀释度，至少取 4 只已经结核菌致敏的体重为400～600g 的白色雌性豚鼠，去毛后于背部脊柱两侧相对部位，分别皮内注射上述稀释度本品各 0.1ml 或 0.2ml，于注射后 24 小时、48 小时观察局部硬结的纵径与横径（可根据48 小时的反应结果判定） 。计算每个稀释度注射后 2 天的硬结反应总和或平均面积，并求其比值，每个稀释度本品与相应浓度标准品的比值应为 0.8～1.2。如不符合上述要求，可调整稀释度后再测定效价，直至符合要求。3.1.5.2 稀释度选择稀释度的选择应能使本品注射后 24 小时所产生的局部硬结反应直径为 8～25mm；本品和标准品的反应直径大小应相似，且本品和标准品的 3 个稀释度的剂量对数反应线应基本平行。如本品效价与标准品效价不一致，可用同样方法复试 1 次，并算出相当于标准品的效价，进行调整，调整后再重新抽样测定效价，直至符合要求。3.1.6 无菌检查依法检查（附录Ⅻ A）应符合规定。3.1.7 无 有毒 分枝杆菌试验 （取消动物法）取 1.0ml 本品，分别接种于 10 支罗氏鸡蛋培养基,37℃培养 4 周,应无分枝杆菌生长。3.1.8 致敏效应试验试验组与对照组分别用体重 300～400g 未做过任何试验的豚鼠各 3 只，试验组每只豚鼠皮内注射 0.1ml 含 500IU 本品，共 3 次，每次间隔 5 天。在第 3 次注射后 15 天，试验组与对照组每只豚鼠各皮内注射 0.1ml 含 500IU 本品，连续观察 3 天，两组动物反应应无明显区别。3.2 半成品检定无菌检查依法检查（附录Ⅻ A）应符合规定。3.3 成品检定3.3.1 鉴别试验取已经结核菌致敏的豚鼠至少 4 只，皮内注射 0.2ml 本品，注射后 24 小时本品的平均硬结反应均应不小于 5mm。3.3.2 物理检查3.3.2.1 外观应为无色澄明液体，无不溶物或异物。3.3.2.2 装量按附录 ⅠA 中装量项进行，应不低于标示量。3.3.3 化学检定3.3.3.1pH 值应为 6.8～7.4（附录Ⅴ A） 。3.3.3.2 苯酚含量应不高于 3.0g/L （附录Ⅵ M） 。3.3.4 效价测定取已经致敏的体重为 400～600g 豚鼠，皮内注射 0.2ml 标准品与本品至少各 4 只，注射后 24 小时、48 小时各观察结果 1 次（可根据 48 小时的反应结果判定） ，计算本品和 TB-PPD 标准品的平均硬结反应（纵横直径相加除以 2） ，计算累计值，并求其比值，应为0.8～1.2。3.3.5 无菌检查依法检查（附录Ⅻ A ） ，应符合规定。3.3.6 异常毒性检查依法检查（附录Ⅻ F） ，应符合规定。4 保存、运输及有效期于 2～8℃避光保存和运输。自 生产 之日起有效期为 1 年。5 使用说明应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。