1IL12 和 IL10 与实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠发病的相关性作者：檀国军, 徐 玉, 王秀丽, 朱一飞, 刘静 , 郭力【摘要 】 目的: 探讨 IL12及 IL10与实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠发病的相关性。方法: 以豚鼠全脊髓匀浆与福氏完全佐剂为抗原免疫 Wistar 大鼠建立 EAE 模型。取脑、 脊髓组织石腊包埋, 病理切片, 光镜观察; 采用双抗体夹心法 ELISA 检测 Wistar大鼠免疫后 7、 14、 21 d 不同时间段血清中 IL12、 IL10的含量。结果: EAE 组免疫后第 7 天 IL12水平即出现明显上调, 早于临床症状的发生, 随免疫后时间的延长, IL12表达呈逐渐增高后缓慢下降的变化趋势, 并且与 EAE 大鼠病情评分呈明显正相关(r=0.951, P0.01)。免疫后第 21 天 EAE 组 IL10水平与 CFA组和 NS 组比较明显升高(P0.01) 。结论: IL12和 IL10分别与EAE 的发病和缓解密切相关。 【关键词】 脑脊髓炎; 自身免疫性; 实验性; IL12; IL10多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是临床常见的中枢神经系统(central nervous system, CNS)炎性脱髓鞘的自身免疫性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune 2encephalomyelitis, EAE)是 CD4+T 细胞介导的 CNS 自身免疫性脱髓鞘疾病, 是 MS 的经典动物模型。目前 MS 的发病机制尚不清楚, Karpus 等1认为与 Th1/Th2 失衡有关。研究表明 , Th1 与Th2 类细胞因子 (cytokine, CK)的表达分别与 EAE 病情进展和缓解相关2 。本研究通过观察 EAE 大鼠血清中 IL12、 IL10水平变化, 目的在于探讨 IL12及 IL10与 EAE 发病的相关性, 以期为深入了解 MS 的发病机制、 探索新的有效治疗途径和病情的监测提供理论依据。1 材料和方法1.1 材料 雌性 Wistar 大鼠(72 只, 68 周龄, 体质量 180200 g)、 清洁级雌性豚鼠(5 只, 体质量 350 400 g)均购自河北医科大学实验动物中心。卡介苗(60 g/L)为北京生物制品所提供; 完全福氏佐剂购自美国 Sigma 公司; IL12、 IL10双抗体夹心 ELISA 试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。1.2 方法1.2.1 动物分组法 将健康、 雌性 Wistar 大鼠 72 只, 随机分 3组: (1)EAE 组, 36 只, 诱导后随机分 7、 14、 21 d 3 个亚组, 每亚组各 12 只大鼠; (2)完全福氏佐剂(complete Freunds adjuvant, 3CFA)组 : 18 只, 以 CFA 免疫大鼠, 分组同 EAE 组, 每亚组各 6 只大鼠; (3)生理盐水 (normal saline, NS)对照组: 18 只, 仅注射 NS, 分组同 CFA 组。1.2.2 完全抗原的制备 健康 350400 g 雌性豚鼠 5 只用 100 g/L 水合氯醛 350 mg/kg 腹腔注射至四肢瘫软, 迅速取其全脊髓。按 1 g 脊髓1 mL NS 在冰槽中用超声细胞粉碎仪制成 500 mL/L的豚鼠全脊髓匀浆(guinea pig spinal cord homogenate, GPSCH),与等量含 4 g/L 卡介苗的 CFA 充分混合至油包水乳剂, 制成完全抗原。1.2.3 建立 EAE 大鼠模型及临床评分 EAE 组经大鼠四肢足垫皮下注射抗原匀浆 0.4 mL/只, 佐剂组为 CFA 代替抗原匀浆同法注射, 正常对照组皮下均注射 NS。记免疫当日为第 0 天, 进行临床症状评分, 参照 Kono 等3 提出的标准, 分为 5 级: 级动物尾部无力; 级尾部无力+肢体无力; 级肢体轻度麻痹; 级肢体严重麻痹, 被动翻身后不能复原; 级濒死状态。1.2.4 组织病理学检查 所有动物于免疫后在不同的时间点处死, 留取血清, 麻醉后先以 NS 左心室冲洗, 再用 40 g/L 多聚甲醛灌注固定, 切取大脑视交叉层面 2 mm 脑组织、 小脑、 脑干、 颈膨大、胸段及腰膨大脊髓固定于 40 g/L 多聚甲醛中 , 石蜡包埋切片, 行4HE 染色。1.2.5 ELISA 检测 血清 IL12、 IL10水平的表达, 用双抗体夹心 ELISA 检测。1.2.6 统计学分析 采用 SPSS11.0 统计软件进行统计分析, 数值用 xs 表示, 单因素多组比较用方差分析, 两组之间比较用 t 检验, 症状评分间比较用相关分析。2 结果2.1 EAE 大鼠的发病情况 EAE 组大鼠免疫后出现精神萎靡、 食欲减退、 皮毛不光滑, 自第 10 天开始发病 , 症状表现为不同程度的尾部张力消失、 无力; 第 14 天进入发病高峰 , EAE 组动物全部发病, 发病率为 100%, 此期症状最严重, 双后肢甚至四肢无力、 麻痹, 大小便失禁, 一只动物因病情严重而死亡 , 平均症状评分 3.880.68; 至第 21 天动物症状缓解, 体质量也逐渐恢复( 图 1)。CFA 组和 NS组大鼠没有发病, 状态及体质量无明显变化。2.2 病理组织学检查 EAE 组发病大鼠脑脊髓组织 HE 染色可见, 在其发病早期 CNS 内有单核淋巴样细胞散在浸润; 发病高峰期 CNS内大量的单核淋巴样细胞浸润, 尤其在小血管周围形成典型“袖套5样(cuffing)”改变(图 2), 提示血 脑屏障( bloodbrain barrier, BBB)被严重破坏; 缓解期 CNS 内单核淋巴样细胞浸润程度明显减轻。病变累及部位涉及大脑、 小脑、 脑干、 脊髓等, 以白质为主。CFA 组和 NS 组大鼠脑和脊髓均未见异常。图 1 EAE 大鼠免疫后临床症状评分图 2 血管套袖样改变 (HE, 400)2.3 血清 IL12水平的变化 EAE 组血清中 IL12在潜伏期( 注射后 7 d)上调, 随着 EAE 大鼠进入症状高峰期(注射后 14 d), IL12水平亦达高峰, 恢复期(注射后 21 d)IL12水平下降, EAE 组在注射后7、 14 和 21 d 血清中 IL12水平分别为(11.4070.208)ng/L 、 (28.1080.028)ng/L 和(14.4560.259)ng/L。EAE 组 3 个时间点IL12水平与对照组相比均有统计学意义(P0.01); 其症状高峰期(注射后 14 d)IL12水平与潜伏期(注射后 7 d) 及恢复期(注射后21 d)相比有统计学意义(P0.05)。图 3 EAE 组与 CFA 组、 NS 组注射后 721 d 血清中 IL12水平比较bP0.01 vs CFA or NS group; dP0.01 vs day 7 or day 621.2.4 血清 IL10水平的变化 在注射后 721 d, EAE 组血清IL10的水平呈逐渐升高的趋势, 潜伏期( 注射后 7 d)和症状高峰期(注射后 14 d)IL10有所表达, 但与对照组血清中 IL10水平比较无统计学意义; 恢复期( 注射后 21 d)水平与对照组比较明显升高(P0.01)。注射后 721 d CFA 组与 NS 组血清中 IL10水平比较无统计学意义(图 4)。2.5 相关性分析 EAE 组注射后 14 d 症状评分与 IL12水平进行相关分析(r=0.951, P0.01), 显示 EAE 症状评分与 IL12的水平呈明显正相关(图 5)。图 5 EAE 组注射后 14 d 血清中 IL12水平与症状评分的相关性3 讨论MS 的病因和发病机制迄今尚未完全明了, 许多研究表明多发性硬化患者中存在 Thl/Th2 类 CK 的失衡, Thl 细胞主要分泌促炎症性CK (如 IL2、 IL12、 IFN、 TNF和淋巴毒素等), 这些 CK通过激活巨噬细胞, 介导迟发性变态反应引发 EAE; Th2 细胞主要分7泌抑炎症性 CK (如 IL4、 IL5、 IL10、 IL6等), 促进 B 细胞增殖成熟, 产生抗体, 故可增强抗体介导的免疫应答, 抑制或逆转EAE 的发生。在 EAE 病情演化中, 由 CK 构成的免疫调节网络对其发生、 发展及缓解起着重要而复杂的调节作用4 。在 EAE 早期的 CNS 巨噬细胞和小胶质细胞上有 IL12受体的表达, 使 CNS 的淋巴细胞发生 Thl 偏移5 。进一步研究发现, IL12R1基因敲除 EAE 鼠发生 Th2 偏移, 因而抑制 EAE 的发展, 而 IL12R2基因敲除鼠仍然发生 EAE6 。IL12p35 基因敲除鼠也同样发生 EAE, 而 IL12p40基因敲除鼠不发生 EAE。有研究认为, 由 APC 分泌的 IL12是导致 Th0 细胞向 Th1 细胞分化产生IFN等促炎细胞因子从而启动针对 CNS 髓鞘成分的自身免疫攻击、 诱发 EAE 的关键因素7 。IL10 作为抑制性 CK 于 1989 年被首次报道, 此后 IL10作为抑制炎症反应的免疫抑制因子被广泛关注。IL10 主要由 Th2 细胞、 单核巨噬细胞和 B 细胞产生。众多的证据已表明 IL10作为抑炎症性 CK 之一, 在调节免疫反应中起着非常重要的作用。Samoilova 等8研究表明, IL10基因敲除的小鼠对实验性变态反应性脑脊髓炎有更强的易感性并且病情更严重, IL10转基因小鼠能抵抗实验性变态反应性脑脊髓炎的发生, 证实了 IL10对 EAE 动物的保护作用。有文献报道, 与 IL4相比, IL10基因缺陷鼠引发严重的 EAE, 说明 IL10抑制 EAE 的地位尚不能被其它 CK 所取代, 其对 EAE 耐受的作用潜力巨大。8通过本实验结果发现, EAE 大鼠在潜伏期 IL12表达即出现明显上调, 早于临床症状的发生, 随免疫后时间的延长, IL12表达呈逐渐增高, 随着 EAE 大鼠进入症状高峰期, IL12表达水平亦达高峰, 恢复期 IL12表达水平下降, 并且 IL12表达与 EAE 大鼠发病呈明显正相关。 但在 EAE 潜伏期和活动期 IL10水平与对照组差异不大; 对比潜伏期、 活动期和缓解期 IL10水平, 后者更高, 提示IL10在 EAE 缓解期起重要作用, 研究揭示在 EAE 小鼠 CNS IL10的表达与 EAE 病情恢复有关。综合上述实验结果, 表明 IL12和IL10的表达分别与 EAE 的发病和缓解密切相关, 在 EAE 的发病早期 IL12和 IL10均表达上调, 其中 IL12的表达与对照组比较有明显差异; 随着 EAE 发病进入高峰期, IL12的表达亦达高峰, IL10的表达变化不明显; 当 EAE 病情缓解时, IL12的表达下降, 而 IL10的表达与对照组比较明显上调。进一步证实 EAE 大鼠发病期 Th1/Th2 类 CK 同时上调, 表现为以 Th1 类 CK 占主导地位的免疫偏离。目前纠正 Th1/Th2 失衡已成为新的治疗策略之一 , 随着对CK 认识的深入, 将有助于发展免疫治疗方法, 进而为临床诊治 MS提供实验依据。【参考文献】 1 Karpus WJ,