1p53 与抗肿瘤免疫【摘要】 p53 是迄今发现的与肿瘤发生、 发展关系最为密切的抑癌基因, 正常的 p53 蛋白通过诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡等途径对细胞增殖发挥负调控作用, 而在肿瘤细胞中异常表达的 p53, 尤其是突变型 p53 蛋白可以诱导机体产生细胞和体液免疫反应, 导致对肿瘤细胞的免疫耐受或排斥。本文中对 p53 的功能、 p53 在抗肿瘤等免疫反应中的作用, 及其在肿瘤治疗中的应用做一综述。 【关键词】 p53; 抑癌基因; 肿瘤免疫p53 是迄今被发现的与肿瘤发生、 发展关系最为密切的抑癌基因, p53 基因的突变见于人类 50%以上的肿瘤1 。正常的 p53蛋白通过诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡等途径对细胞增殖发挥负调控作用, 并促进细胞分化, 同时 p53 对于维持遗传物质的稳定性发挥极其重要的作用。由于点突变、 基因片段缺失和 p53 蛋白失活等导致的 p53 功能缺陷, 可以通过多种分子机制引起细胞过度增殖和遗传物质的改变, 以及逃避机体对癌变细胞的免疫监控作用, 最终导致肿瘤的发生2 。同时 , 在肿瘤细胞中异常表达的 p53, 尤其是突变型 p53 蛋白可以诱导机体产生细胞和体液免疫反应3 。因此, 通过检测 p53 基因结构和功能的改变, 以及体内 p53 特异性 T 细胞的活化和抗体产生, 可以为肿瘤的早期诊断提供依据, 而 p53 抗原2肽或野生型 p53 的应用, 将有助于激发抗肿瘤免疫反应和纠正肿瘤细胞的恶性表型, 从而为肿瘤的免疫治疗带来新的希望。1 p53 基因及其生物学功能概述人类 p53 基因定位于染色体 17p13.1, 全长 16 00020 000 bp, 由 11 个外显子和 10 个内含子组成, 编码由 393 个氨基酸残基组成、 相对分子质量（Mr）为 53 000 的蛋白。野生型 p53蛋白是一种定位于细胞核中的转录因子, 其活性形式为四聚体, 自N 端起依次为转录活化区、 DNA 结合区、 四聚体化区和 C 端调节区。p53 活性受到磷酸化、 乙酰化等调节, 第 15 位和 37 位丝氨酸的磷酸化, 以及第 373 和 382 位赖氨酸的乙酰化都可以显著提高p53 蛋白的转录激活能力4 。另外, 癌基因产物 Mdm2 与 p53结合后, 能够诱导后者发生 p53 发生泛素化降解 , 也成为细胞内p53 功能调节的重要方式5 。当细胞面临 DNA 损伤、 纺锤丝断裂、 癌基因异常激活、 缺氧, 细胞内 dNTP 不足等不利因素时, 在上游信号分子的作用下, p53 表达上调, 或细胞原有的 p53 通过磷酸化而活化, 使 p53 的胞质含量、 稳定性及转录活性均显著增加2, 5 。活化的 p53 蛋白通过调控其靶基因的表达以及下游信号传递, 引起多种生物学效应, 主要包括: （1 ）细胞周期阻滞。p53 活化后, 3可以启动细胞周期负调控相关基因 p21waf 1/cip 1, 1433 和cyclin G 等的转录表达。以 p21waf 1/ cip 1 为例, 该蛋白可以通过抑制细胞周期素/细胞周期素依赖性激酶复合体的活化 , 使细胞周期停滞于 G1 期。 （2）DNA 损伤修复。细胞周期的停滞使损伤的DNA 分子有机会得以修复。在电离辐射的诱导下, p53 蛋白通过与gadd 45 基因内含子中一段序列结合, 上调该基因的表达, 而 gadd 45 通过激活 cdc 2 基因促进基因组 DNA 修复。 （3 ）细胞凋亡。在特定情况下, 如 DNA 严重损伤或修复失败时, 活化的 p53 作为转录因子, 可以直接启动细胞凋亡相关基因 bax、 gml、 p2xm、 killer/dr 5 和 pag 608 等的表达, 促进细胞凋亡6, 7 。p53 对于维持细胞、 组织乃至生物个体的功能和代谢具有至关重要的作用。除了维持细胞基因组的稳定性、 防止癌变外, p53对于糖代谢、 能量的产生, 以及细胞老化等生理过程都具有重要的调节作用8, 9 。2 p53 与机体免疫反应p53 与机体免疫系统的功能和免疫反应关系密切, 表现在: 一方面 p53, 尤其是突变型 p53 可以作为肿瘤相关抗原激发机体免疫反应; 另一方面, p53 作为转录因子, 可以直接启动免疫细胞中一些基因的表达, 从而对这些细胞的增殖和功能发挥调节作用。421 p53 蛋白的免疫原性 在正常细胞中, 由于 Mdm2 结合引发的高效泛素化降解作用, p53 蛋白的含量非常低 , 而且主要分布于细胞核中。尽管在 T 淋巴细胞发育的阴性选择过程中, 胸腺中表达的 p53 蛋白可以介导 p53 反应性 CD8+ T 细胞的克隆删除, 但由于 p53 表达和暴露有限, 加之 p53 蛋白通常并不呈现在一些实质组织细胞表面, 因此这种删除是不彻底的。在肿瘤细胞中, 由于野生型或者突变型 p53 的过量表达, 尤其是在细胞质中浓度的增加 , 使少量坏死肿瘤细胞释放的 p53 能够被抗原提呈细胞摄取、 加工并提呈给 T 细胞, 使 p53 特异性 T 细胞活化, 激发机体抗肿瘤免疫反应。研究显示, 来源于野生型和突变型 p53 蛋白的特定肽段均可以诱导正常或荷瘤小鼠体内 MHC II 限制的 CD4+ T 细胞活化, 而包含突变氨基酸残基的肽段通常显示出更强的诱导 T 细胞活化的能力。在肿瘤发生、 发展的不同阶段 , 活化的 p53 特异性 CD4+ T 细胞可以分泌 IL2、 IFN 等 Th1 类细胞因子, 进一步激发抗肿瘤免疫反应, 也可能产生 IL4、 IL5、 IL10 等 Th2 类细胞因子, 介导免疫耐受, 从而产生完全不同的效应。但只有在少数情况下, 这类针对 p53 的免疫反应可以有效地抑制肿瘤的生长, 甚至导致肿瘤彻底消失10 。除了激发细胞免疫, 野生型和突变型 p53 蛋白也能够诱导机体产生自身抗体。Schlichtholz 等11在 30%的乳腺癌患者体内5检测到了 p53 抗体, 而在结肠癌患者中这个比例约为 26%。这些抗体主要针对包含 p53 突变位点的抗原肽段。同时, 尽管 p53 抗体的产生在乳腺癌和一些消化系肿瘤中似乎与晚期肿瘤以及患者低存活期相关, 但在大多数肿瘤中, 它与肿瘤大小、 分期并没有相关性。22 p53 的两类抗原表位 在野生型或者突变型 p53 蛋白中, 存在两类抗原表位: 一类为优势表位（ dominant epitope）, 它们在 T 细胞发育的阴性选择阶段或者成熟的外周免疫器官中充分暴露, 被加工提呈后引起相应 T 细胞克隆删除或者活性抑制, 使机体对这类抗原产生免疫耐受。另一类为隐蔽表位（cryptic epitope）, 含有这类表位的肽段由于在发育中的胸腺和正常外周组织中不被充分暴露、 不能被抗原提呈细胞加工 , 或者在与结合相同 MHC 分子的优势表位的竞争中处于劣势等原因, 不能有效地被提呈给相应的 T细胞克隆, 因而不能诱导中枢或者外周免疫耐受。在特定生理状况下或特定组织（如肿瘤）中, 当这类抗原表位大量存在或者被有效地加工提呈时, 就可能诱发针对这种抗原的免疫反应。在 p53 蛋白中, 这些能够诱导机体免疫反应的隐蔽抗原表位主要位于 N 端或 C端结构域, 而较少存在于处在一级结构中心区域的 DNA 结合结构域10, 11 。例如, 在肿瘤患者体内, 含有第 150 位氨基酸序列（AA150 ）的肽段可以有效地诱导 T 细胞活化 , 但它们活化后的效应与肿瘤的发展阶段关系密切, 通常临床期和期的患者较之期患者更倾向于产生 Th2 类细胞因子。相比之下 , AA3313706诱导 T 细胞活化后产生的细胞因子与肿瘤分期关系不大。在很多肿瘤细胞中, 由于突变导致 p53 蛋白在细胞质中大量聚积 , 使突变的p53 蛋白被蛋白酶体降解, 或者释放后被抗原提呈细胞摄取、 加工, 分别通过 MHC 和 MHC 限制的途径活化 CD8+和 CD4+ T细胞, 诱导针对相应抗原的免疫反应。然而有证据表明, 在野生型和突变型 p53 蛋白中, 能够诱导 T 细胞活化并产生 Th1 类细胞因子的抗原表位远远少于能够使活化 T 细胞分泌 Th2 类细胞因子的表位, 因此所有抗原表位作用的总效应通常是诱导机体产生针对 p53 的免疫耐受。23 p53 与免疫调节 p53 除了作为抗原诱导机体免疫反应之外, 还可能通过激活免疫系统相关基因的表达直接参与免疫调节。在 p53 基因缺陷小鼠中, 免疫系统的发育和老化过程均显著加快, 并引起记忆性 T 细胞过度积累12 。在细胞凋亡过程中, 凋亡细胞释放大量自身抗原, 但这些抗原很少诱发自身免疫反应。研究表明, 一种可能的机制是 p53 作为转录因子直接上调主要抗原提呈细胞树突状细胞中 CD200 的表达, 而后者可以显著抑制 T 细胞活化和免疫反应13 。另一项研究显示, p53 的表达对于抑制肠道黏膜固有层T 细胞的增殖, 以及维持其对抗原的免疫耐受状态具有重要意义14 。巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）通过抑制 p53 在细胞中的积累和活化维持巨噬细胞的存活和功能, 因而在机体天然免疫中发挥调节作用15 。73 p53 与肿瘤免疫和基因治疗3.1 基于 p53 免疫原性的肿瘤治疗 尽管 p53 蛋白诱导的细胞和体液免疫通常导致机体对肿瘤细胞的免疫耐受, 但由于不同抗原肽引起的免疫反应不同, 因此那些能够特异地活化 Th1 细胞的肽段仍然有可能被用来诱导抗肿瘤免疫反应。例如 p53 蛋白第261 269 位氨基酸肽段已经被用来制备肿瘤疫苗10, 16 。p53基因修饰树突状细胞疫苗在免疫荷瘤小鼠后, 可以有效地激发针对肿瘤细胞的 CTL 反应。目前, 如何通过筛选和修饰获得与 MHC 分子具有高亲和力的肽段, 以及通过封闭 T 细胞表面抑制性受体（如CTLA4）和调节性 T 细胞的功能增强 T 细胞免疫反应 , 克服免疫耐受状态, 是这类疫苗在肿瘤治疗中成功应用的关键16 。3.2 基于 p53 蛋白功能的肿瘤治疗 由于 p53 能够有效地抑制细胞增殖和促进细胞凋亡, 而且人类近半数的肿瘤都与 p53 突变和失活有关, 因此在肿瘤细胞中恢复表达野生型 p53 蛋白将有助于逆转肿瘤的恶性表型, 抑制肿瘤生长。目前这一策略已被广泛应用于非小细胞肺癌、 白血病、 胶质母细胞瘤、 卵巢、 结肠和肾脏等部位肿瘤的治疗17 。另外, p53 的应用还可以显著增强肿瘤对化疗、 放疗等传统治疗方法的敏感性, 增加治疗的效率18 。近年来, 通过腺病毒等载体介导 p53 基因转移并表达于肿瘤细胞 , 已经形成了多种临床治疗方案, 在美国、 日本和欧洲等国家和地区, 8以及包括头颈部肿瘤、 肺癌、 肝癌、 乳腺癌、 脑瘤等多种肿瘤的治疗中得到成功应用, 并且在一些晚期肿瘤的治疗中显示出独特优势19 。值得一提的是, 2003 年我国率先批准了国家一类新药重组腺病毒 p53 注射液进入市场, 成为世界上第一个基因治疗产品, 为许多晚期肿瘤患者带来了新的希望20 。尽管 p53 蛋白主要通过其对细胞增殖的负调控作用发挥抗肿瘤作用, 但 p53 的免疫原性也是 p53 应用于肿瘤治疗的重要原因。以 p53 重组腺病毒为例, 这类制剂对一些与 p53 突变和功能失活无关的肿瘤同样具有显著的治疗作用, 提示 p53 蛋白本身甚至腺病毒本身的免疫原性在其中发挥了重要作用19 。总之, p53 在肿瘤治疗中的成功应用将有赖于人们对 p53 功能及其在机体抗肿瘤免疫反应中作用的深入认识。【参考文献】1 Royds JA, Iacopet