1可注射性组织工程软骨源性微载体的微观结构及其生物相容性观察作者：卢强，张莉，彭江，许瑞江，黄靖香，郭全义，卢世璧【摘要 】 目的改进软骨源性微载体的制备方法。对其微观结构特征及其与骨髓间充质细胞的生物相容性进行观察，探索新的可注射性组织工程软骨的制备方法。 方法将新鲜的猪关节软骨在液体中粉碎，梯度离心后制备成 150300 m 的颗粒，去细胞处理后采用常规组织学方法观察软骨微粒的空间结构及化学组成，采用扫描电镜观察软骨源性微载体的形态特征，随后体外获取扩增骨髓间充质细胞，与软骨微粒复合，然后采用旋转式生物反应器扩增，构建可注射性组织工程软骨细胞。 结果本研究制备的软骨微粒呈圆形或椭圆形，表面呈毛刷状结构，主要成分是型胶原和 GAG，而毛刷的主要成份型胶原、骨髓间充质干细胞不仅与微载体结合良好，还能够在其表面大量扩增。 结论与传统的微载体不同，软骨源性微载体与细胞复合后，不需要再将细胞消化，避免了软骨细胞外基质的损失，可以作为可注射性组织工程软骨的理想材料和方法。 【关键词】 微载体； 软骨； 骺损伤； 组织工程2Abstract: ObjectiveTo improve the preparative method of catilage derived microcarrier and evaluate the micromechanism and biocompatibility of this metarial for injectable tissue engineering cartilage. Methods Fresh porcine articular cartilage were obtained and shattered in the iso-osmia liquid in 4. After gradient centrifugation, 150-300 m size cartilage micelles were gathered and were subjected to 1% Triton X- 100 once and physiological saline twicely. The structure of specimens were observed and assessed by inverted phase contrast microscopy,environmental scanning electron microscope.And the composition of these specimens were stained with haematoxylin-eosin, safranin-O, toluidine blue and immunohistochemistry of collagen type .The microcarriers were seeded with rabbit bone mesenchymal stem cells (BMSCs) and cocultured with Rotary Cell Culture System (Rotary Cell Culture System, RCCS TM).ResultsThe cartilage particles had fiocculus apparence.There were numerous villus on the surface of these cartilage micelles, which were stained positive with the immunohistochemistry of collagen type .The inner part of these cartilage micelles were stained positively with safranin-O and toluidine blue. After coated with BMSCs and cultured in the RCCSTM, the 3cells grew well on the surface of the cartilage micelles and the latter could be disperse again after blowed with pipette.Conclusion The cartilage micelles, which have large surface area and good boicompatibility,is a new kind of microcarrier for injectable tissue engineering cartilage.Key words：microcarrier； cartilage； epiphysis injury； injectable儿童骺板损伤是小儿骨科常见的一种难治性疾病。儿童骺板损伤后，往往会造成骺板早闭，骨桥形成，进而并发肢体畸形和功能障碍，影响儿童的生长和发育。对于儿童骺板损伤的治疗，最常见的方法是将骨桥切除，采用脂肪或其它填充物填充1 。近年来，填充方法不断扩展，采用组织工程的方法填充组织工程骺软骨可能是一种有前途的方法。本研究采用软骨源性微粒，结合微重力生物反应器技术，体外扩增细胞，制备出一种可注射性的组织工程骺软骨，现报道如下。1 实验材料和方法1.1 软骨源性微载体的制备4对文献中的微载体的制备方法进行改进2、3：无菌条件下取正常新鲜猪膝、髋关节软骨，将关节软骨浸泡于 4下 PBS 缓冲液(pH 7.5)，缓冲液含 0.035%(wv)的苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)和 0.1%(wv)的乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)。液态条件下用粉碎机粉碎，采用 AllegraX-22R 型离心机(F0850 转头，Beclonan 公司，美国) 梯度离心，获取直径 100300 m 软骨微粒。4下加入含 1%Triton X-100(北京化学试剂公司) 的 10 mmolL Tris-HCl 缓冲液(pH 7.5)，缓冲液中 PMSF 含量同上。持续振荡 2472 h，去除细胞成分。以 1 000 rmin 离心 5 min 后PBS 冲洗。37下加入 50 UmLDNA 酶(Sigma 公司，美国)和 1 UmLRNA 酶(Sigma 公司，美国)消化 1248 h。同上法离心后三蒸水冲洗后，静置。收集沉淀并封装。25 kGy60CO 照射 24 h消毒灭菌。-20 保存备用。1.2 骨髓基质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)分离、培养与扩增根据参考文献方法4 分离培养骨髓基质干细胞。选择髂后上棘为穿刺点。16 号骨髓穿刺针用肝素钠稀释液预湿后刺入皮下，确定在髂后上棘的进针点，轻度斜向尾侧进针 34 mm 深，检查穿刺针固定于髂骨上。取出针芯，连接 10 ml 注射器，内含肝素钠稀5释液 1.0 ml(肝素钠 3 000 u)，抽取骨髓液 56 ml。按 11 体积比将抽取的骨髓沿管壁缓慢滴加底部装有 Percoll(比重 1.073 gml)分离液的离心管中，2 000 r/min 离心 20 min。用吸管收集中间的单个核细胞层(雾状白膜层) ，Hanks 液洗涤 2 次。收集细胞沉淀，用含 10%FBS 的 DMEM 培养液 5106ml 混匀后接种于培养瓶中，置于 37，5%CO2 孵箱中培养。4 d 后首次换液。此后每周换液 2 次，筛除未贴壁生长的细胞。倒置相差显微镜(Olympus 公司，日本)下观察原代细胞汇合达 80%90%时，即可进行传代。在 P3 代以前使用。BMSCs 与软骨源性为载体的复合与扩增：采用 1 ml 注射器将P3 代的 BMSCs 按 2104mL 密度与软骨微粒复合，于 37 、5%CO2 孵箱内孵育 1 h，随后将 BMSCs 与软骨微粒复合体置于三维微重力旋转式细胞生物反应器(rotary cell culture system，RCCSTM，美国)进行培养，3 d 后吸取培养液在倒置显微镜下观察细胞在软骨微粒上的黏附与生长情况。1.3 观察指标1.3.1 组织化学染色观察甲苯胺蓝染色、番红 O 染色：将制备的软骨微粒悬液涂于载玻6片上，10%中性福尔马林固定 12 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，进行甲苯胺蓝染色、番红 O 染色，光镜下观察。免疫组织化学染色：将制备好的软骨微粒涂片 4%的多聚甲醛固定液固定，漂洗后晾干，脱蜡至水，3%H2O2甲醇室温孵育 10 min，漂洗后封闭。滴加鼠抗人 型胶原(1100)、4过夜。再次漂洗。加入生物素标记二抗工作液孵育 30 min。滴加辣根酶标记链卵白素。DAB H2O2 显色，苏木素复染，树脂封片。显微镜观察。1.3.2 支架材料的微观结构显微镜观察：将软骨源性微粒悬液涂片置于显微镜下观察微粒的形态和表面结构特点。扫描电镜观察：将软骨源性微粒悬液涂片，2.5%戊二醛 4固定 24 h，pH7.4 的 PBS 冲洗，1% 锇酸 4固定 4 h，梯度乙醇脱水，CO2 干燥器干燥、喷金、黏托，扫描电镜观察。2 结果2.1 软骨源性微载体的结构和组成7显微镜下见软骨源性微载体呈现为心形、椭圆形或圆形绒球状(图 1、2) ，软骨微粒大小 150300 m，表面绒毛密集覆盖，绒毛长度接近甚至大于软骨微粒本身的直径，微绒毛的靠近软骨微粒的部分甲苯胺蓝染色(图 4)和番红“O”染色(图 3)强度较周边部明显，而型胶原的染色却是周边部明显(图 6)。对于软骨微粒本身以上三种染色都是强阳性。环境扫描电子显微镜下观察，见软骨表面覆盖大量微绒毛，微绒毛呈束状离心排列，基底部与软骨微粒的体部紧密相连，微绒毛直径 45130 nm 之间(图 5)，呈丝状，表面有浆状物质包裹。2.2 软骨源性微载体的生物相容性观察支架与 BMSCs 复合后，在 RCCSTM 中培养 72 h 后的外形保持良好，软骨微粒绒球状外观消失，表面微绒毛消失，替代以大量细胞覆盖(图 7)。在生物反应器内培养 72 h 后，虽然表面上软骨块之间有聚集，但是采用吸管轻轻吹打，就可将其均匀分散。另外，在取样过程中，采用常规的 16 号注射器针头，很容易将其带有细胞的微载体抽出。3 讨论8儿童骺软骨损伤是小儿骨科临床上常见的一种难治性损伤。骨骺损伤的类型(Salter-Harris 分型 1963 年)包括：型骨折线通过骺板软骨成熟区细胞退化层，如全骺分离，型骨折线通过骺板软骨成熟区细胞退化层，到达骺板边缘前折向干骺端，型骨折线从关节面开始，通过骨骺进入骺板软骨成熟区细胞退化层，然后 90转弯沿软骨成熟区细胞退化层直达骺板边缘，型骨折线从关节面开始，经骨骺、骺板全层和干骺端 3 部分，V 型垂直挤压暴力引起的骺板软骨压缩骨折，型为骺板软骨膜环(Ranvier 软骨膜沟)损伤。无论是哪一种损伤都有可能造成骨桥形成，骺板早闭，最终导致肢体畸形和功能障碍，影响儿童骨骼发育。目前采用的最常见的治疗方案为骨桥切除，填充以有活性的组织，如自体脂肪、肌肉、肌腱、软骨、骺板，或无活性的填充物，如明胶海绵、骨水泥、医用胶等5 。这些材料或由于取材困难，或由于不能有效阻止骨桥形成而存在这样或那样的缺点。组织工程技术的兴起，给骺损伤的治疗带来了希望，采用自体骺软骨细胞或干细胞移植构建具有再生活性并能阻止骨桥形成的组织工程骺软骨成为治疗