1外周血单核细胞诱导的 CD123+髓系树突状细胞的特性研究作者：石军, 王敏, 万云 , 池田和真【摘要 】 目的: 探讨体外髓系培养体系中外周血单核细胞来源的 CD123+髓系树突状细胞（mDC）的生物学特性。方法: 分离健康人外周血单核细胞, 用重组的粒/单核细胞集落刺激因子（GMCSF ）和白细胞介素 4（IL4 ）将其诱导为树突状细胞（DC） 。用流式细胞术（ FCM）检测 DC 表面共刺激分子、 CD304 、 CD123 和 CD11C 的表达, 并用间接免疫磁珠法将其中CD123+DC 加以分离纯化 ; 激光共聚焦显微镜、 扫描电镜观察CD123+DC 形态; ELISA 法检测 CD123+DC 的 IL12 分泌量; 葡聚糖吞噬试验和 3HTdR 渗入法分别检测 CD123+DC 的吞噬功能和对同种异体 T 细胞的刺激能力。结果: 外周血单核细胞经GMCSF 和 IL4 诱导 7 d 后, 细胞表面高度表达 CD86 和 CD11C, 中等量表达 CD1a 和 CD123, 低表达 CD83, 丧失 CD14 的表达, 其中, CD123 和 CD11C 均匀分布于 DC 表面。免疫磁珠纯化后的CD123+DC 呈现典型的不成熟 DC 形态, 除细胞体积较小外, 其表面突起类似于 CD123-DC。CD123+DC 仅微量分泌 IL12, 其吞噬能力强于 CD123-DC（P0.05 ）, 但抗原刺激功能低于后者（P0.05） 。结论: GMCSF 和 IL4 培养体系中的 CD123+DC2可能是 DC 分化发育过程中更早期的未成熟 mDC, 具有独特的生物学特性。 【关键词】 髓系培养体系; 髓系树突状细胞; CD123Abstract AIM: To investigate the biological characteristics of CD123+DC derived from cord blood monocytes in myeloid culture system. METHODS: The monocytes isolated from peripheral blood were cultured with GMCSF and IL4 to induce DC for 7 days, and the related phenotype of DC was analyzed by flow cytometery. CD123+DC were purified with magnetic cell sorting separation technique. The morphological properties of CD123+DC was observed under confocal laserscanning microscope and scan electron microscope. The concentration of IL12 secreted by DC was analyzed by ELISA. The function of endocytosis and antigen presentation was evaluated by uptaking FITCdextran and allogeneic mixed T lymphocyte reaction (MLR). RESULTS: FACS analysis showed the high expression of CD86 and CD11C, moderate expression of CD1a and CD123, low levels of CD83 on DC after induction by GMCSF and IL4 for 7 days, while the expression of CD304 3was rather low. Welldistributed CD123 and CD11C were detected on DC. Purified CD123+DC showed typical morphology of immature DC with similar short cytoplasmic projections as CD123-DC. CD123+DC secreted lower level of IL12, and exhibited more significant endocytosis and less antigen presentation function than that of CD123-DC（P1104。另将双标记组细胞悬液滴片 , 100 g/L 缓冲甘油封片, 置共聚焦显微镜下观察 DC 表面 CD123 和CD11C 分布情况。6123 间接免疫磁珠分选CD123+DC 将培养第 7 天的 DC 由培养板中取出, 加入 PE标记的鼠抗人 CD123 抗体（2 L/106 细胞）, 4孵育 30 min, 充分洗涤后加入磁珠连接的抗 PE 抗体, 4孵育 15 min, 通过阳性分选柱, 得到的阳性细胞命名为分 CD123+DC, 阴性组分命名为CD123-DC。124 扫描电镜形态学观察将 CD123+DC 按照常规法爬片, 用 30 mL/L 戊二醛固定, 经乙醇梯度脱水, 临界点干燥, 真空镀金胶体后置于扫描电镜下观察, 并与 CD123-DC 进行比较。125 IL12 含量测定分离纯化后的 CD123+DC 和 CD123-DC 分别用 DC 条件培养液调整细胞密度至 5108/L, 继续培养 24 h, 收集上清, 按照ELISA 试剂盒说明书, 检测 IL12 含量, 每组设 3 个复孔。126 吞噬功能测定7将 CD123+DC 和 CD123-DC 分别与 FITCdextran（0.5 g/L） 37孵育 1 h, 用 PBS 洗涤 5 次后置流式细胞仪上检测。127 CD123+DC 对同种异体 T 细胞增殖的影响采用常规磁珠分选方法, 用抗 CD4 磁珠从外周血单个核细胞中分选 CD4+T 细胞, 用 RPMI1640 培养液离心洗涤, 调整细胞密度为 1109/L, 每孔 100 L 接种到 96 孔培养板。将 CD123+及CD123-DC 用 射线照射灭活, 与 T 细胞以 110 比例混合培养, 同时以未加 DC 的 T 细胞为对照组, 每组设 3 个复孔, 置 37 培养5 d。于培养结束前 16 h 加入 3HTdR（0.5 Ci/孔）, 收集细胞后用液闪仪检测 cpm 值, 结果取 3 个孔的平均值。128 统计学分析计量资料以 xs 表示, 两均数比较采用 t 检验, P0.05 时有统计学意义。2 结果2.1 DC 的表型8外周血单核细胞培养 7 d 后, 单核细胞特异性标记 CD14 几近消失(未显示 ), 共刺激分子 CD86 高表达, 但成熟标记 CD83 低表达, 部分细胞表达 CD1a（图 1）, 结合典型之 DC 形态, 表明单核细胞已被诱导为 DC。几乎所有的细胞均表达髓系标记 CD11C, 其中, 21.3%的细胞表达 CD123, 但均不表达体外诱导的 pDC 的特异性标记 CD304。2.2 CD123+DC 的纯化效果采用间接免疫磁珠阳性分离法。CD123 阳性细胞在分离前初始含量 38.2%, 经 MiniMACS 分离纯化, 纯度达到 98.0%(图 2)。2.3 CD123+DC 的形态CD14+单核细胞在 GMCSF 和 IL4 的联合作用下, 于培养第 2 天开始出现不规则形态的细胞 , 少数贴壁生长, 大部分细胞悬浮生长; 于培养第 7 天时细胞体积已明显增大, 表面伸出许多毛刺, 大部分细胞悬