1大黄、当归多糖对巨噬细胞甘露糖受体作用的研究【摘要】 的: 探讨当归多糖（APS） 、 大黄多糖（RTP）与腹腔巨噬细胞（M）甘露糖受体（MR ）的结合特性及其对腹腔 M免疫功能的影响。方法: 以异硫氰酸荧光素标记的甘露糖化牛血清白蛋白(ManFITC BSA)可特异性的与甘露糖受体相结合为模型, 以甘露糖为阳性对照、 半乳糖为阴性对照, 通过竞争性抑制实验, 将APS、 RTP分别与腹腔 M共同孵育 60 min后, 用荧光显微镜和多功能酶标仪检测腹腔 M摄取 ManFITCBSA的情况; 通过ELISA方法检测 APS、 RTP刺激 M分泌 TNF及 IL4的情况。结果: D甘露糖、 APS、 RTP均可抑制腹腔 M吞噬ManFITCBSA , 而 D半乳糖则没有此作用; APS、 RTP均可诱导腹腔 M分泌 TNF,且呈剂量依赖性, 甘露糖可完全阻滞 RTP诱导 M分泌 TNF, 对 APS诱导 M分泌 TNF只有部分对抗作用; 两种多糖对 IL4的分泌没有统计学意义 ; 甘露糖不能诱导 M分泌 TNF与 IL4。结论: RTP引起的 M分泌 TNF作用是通过甘露糖受体介导, 而 APS的作用不仅仅与甘露糖受体有关。两种多糖与甘露糖受体的作用差异可能与其单糖组成密切相关。 【关键词】 巨噬细胞 甘露糖受体 大黄多糖 当归多糖 肿瘤坏死因子 白细胞介素42许多中药多糖能够刺激巨噬细胞（Macrophage, M）释放前炎症因子或者某些细胞因子, 推测其可能机制与 M膜上的模式识别受体（pathogen recognition, PRR）结合引起细胞内某些信号通路的活化有关。前期研究发现, 当归多糖（Angelica sinensis Diel polysaccharide, APS）能够促进树突状细胞的成熟, 增强抗原提呈能力1, 2; 促进脾细胞 IL2、 IFN的分泌3; 而RTP（Rheum tanguticum polysaccharide, RTP）能够对抗结肠炎大鼠 CD4+T细胞的扩增 , 降低克隆氏病大鼠 IFN的升高, 升高结肠炎小鼠降低的 IL4水平4, 5 。但是 RTP和 APS的免疫反应作用机制, 尚不清楚。M是体内特定的吞噬细胞和抗原提呈细胞, 是连接先天免疫系统及后天免疫系统的桥梁。其表面众多膜受体参与完成这些功能, M甘露糖受体 (Macrophage Mannose receptor, MMR)为其中之一。研究表明, MR是一种 PRR, 可特异性地识别以甘露糖、 N乙酰葡糖胺或岩藻糖为末端的配体并与之结合6 , 这些配体可来源于内源性或外源性分子。推测 MR在病原体的识别、 吞噬与清除, 在结核、 肿瘤、 感染等许多疾病过程中都发挥着重要的作用。我们的研究表明, RTP含有近 50%的甘露糖7, 组分 RTP1, RTP2所含单糖比例不同; APS则含有 N乙酰3葡糖胺残基1, 组分 APS1, APS2, APS3所含单糖比例也不同。这两种多糖的免疫调节作用可能是通过 MMR而起效的。本研究将探讨 APS混合组分、 RTP混合组分对 M吞噬及分泌细胞因子的影响, 以揭示两种中药多糖的免疫调节作用。1 材料和方法1.1 材料SD大鼠（200220 g, 雌雄各半）, 由第四军医大学动物实验中心提供, 动物分笼饲养于空调温室内 , 温度 222, 相对湿度50%60%, 自动调控昼夜各 12 h, 颗粒饲料喂养, 自由饮水。RPMI1640培养基购自 Gibco公司, 胎牛血清购自杭州四季青公司生物制品厂, PBS缓冲液购自博士德生物工程公司, 甘露糖购自上海试剂二厂; 半乳糖购自国药集团化学试剂有限公司; APS及 RTP由我实验室提供, EDTA以及异硫氰酸荧光素标记的甘露糖化牛血清白蛋白(ManFITCBSA) 购自 Sigma公司; GENios pro多功能酶标仪为瑞士 TENCN公司产品 ; Nikon H600L荧光显微镜为日本Nikon公司产品。1.2 方法41.2.1 腹腔 M的分离、 纯化及培养取 6只雌性 SD大鼠, 乙醚麻醉, 750 mL/L乙醇浸泡 1 min, 取出, 消毒腹部皮肤, 打开腹壁, 但勿伤及腹膜。用注射器向腹腔内注入 PBS 10 mL, 轻揉腹腔 5 min, 剪开腹膜, 用吸管吸取腹腔内液体, 注入离心管, 1 000 r/min 离心 5 min。弃上清, 分别加入 6 mL含 100 mL/L胎牛血清的 RPMI1640培养液, 吹打混匀后计数, 调整细胞密度为 1109个/L, 分别接种腹腔 M于对应的培养板中, 置 37 50 mL/L CO2孵箱中培养。3 h后轻轻吸弃培养液后, 再用 PBS洗去未贴壁细胞, 重复 3次, 每孔加入含 100 mL/L胎牛血清的 RPMI1640培养液 , 用姬姆萨 瑞氏染色法染色, 观察 M占 95以上8 。纯化后的单层大鼠腹腔 M用含 100 mL/L小牛血清的 RPMI1640培养液置于 37 50 mL/L CO2孵箱中培养。1.2.2 荧光显微镜观察 MFITCBSA与 M的结合能力取纯化腹腔 M, 以每孔 1106个腹腔 M接种于底部覆盖玻片的 6孔培养板, 纯化后分为 3组: 空白对照组（2 mL 500 mL/L RPMI1640/PBS缓冲液）; ManFITCBSA阳性对照组（2 mL 0.01 g/L ManFITCBSA）; 甘露糖加 MFITCBSA实验组（1 mL 1 g/L Man+1 mL 0.01 g/L ManFITCBSA） 。用锡铂纸5包严培养板, 置 37 50 mL/L CO2孵箱中避光孵育 60 min; 用PBS冲洗接种有 M的盖玻片 3遍, 40 g/L多聚甲醛固定 30 min, PBS洗片, 晾干后滴上 500 mL/L的甘油 PBS 10 L, 石蜡封片, 4短时储存留待观察。荧光显微镜激发光谱 495 nm, BA520阻挡滤光片, DM505二向分色滤光片。1.2.3 多糖对 M吞噬 ManFITCBSA的影响取纯化腹腔 M, 以每孔 1104个接种于 Costar96孔底部透明板, 置 37及 4, 50 mL/L CO2孵箱中孵育 4 h, PBS冲洗 3遍, 分别加入不同浓度的甘露糖（Man ） 、 半乳糖(GaL)、 APS混合组分、 RTP混合组分以及 ManFITCBSA, 每组 3个孔各加100 L, 置 37及 4, 50 mL/L CO2孵箱中避光孵育 60 min后, 弃上清, PBS冲洗 3遍, 重复 3次9 。1.2.4 多糖对 M分泌细胞因子的影响取纯化 M, 以每孔 1104个腹腔 M接种于 Costar96孔培养板, 分别与 APS、 RTP、 Man、 APS+ Man、 RTP+ Man在 37, 50 mL/L CO2孵箱中培养 36 h, 取细胞上清按照试剂盒说明（Rat IL4 ELISA Kit, Rat TNF ELISA Kit, BOSTER）测定细胞因子水平。简述如下: 在酶标板加入 100 L不6同浓度的标准品, 绘制标准曲线, 在反应孔中加入待测样品的 M培养液上清各 100 L, 然后加入 100 L生物素标记抗体, 37 反应 1 h, 0.01 mol/L PBS洗板 3次, 然后每孔加入 100 L亲和素 过氧化物酶复合物（ABC）, 37反应 30 min, 洗板 5次, 加入 TMB显色液, 避光反应 1025 min, 加入 TMB中止液, 450 nm测定光吸收值。1.2.5 统计学处理数据以 xs表示, 利用 SPSS11.0软件进行分析 , 显著性检验采用 t检验及 SNKq检验, P0.05为差异具有统计学意义。2 结果2.1 甘露糖抑制 M吞噬 ManFITCBSA 采用荧光显微镜观察腹腔 M吞噬 ManFITCBSA的情况(图 1A), 通过竞争抑制试验观察到: D甘露糖可以抑制该现象( 图 1B)。2.2 多糖对 M吞噬功能的影响采用多功能酶标仪检测 M吞噬 ManFITCBSA的能力, 实验结果表明: 在 37时, M吞噬活性与 ManFITCBSA浓度7呈正相关, 在 4时, ManFITCBSA与 M为非特异性吸附, 荧光强度不随 ManFITCBSA浓度改变而发生变化（图 2）; ManFITCBSA与 MMR的结合为 Ca2+依赖性, EDTA可阻断该过程（图 3）, 其阻断能力与 EDTA浓度呈正相关 ; 甘露糖作为 MR的阻断剂, 也阻断该过程, 其拮抗能力与甘露糖浓度相关, 半乳糖则不能阻断 MR介导的 M对ManFITCBSA的吞噬作用（图 4）; APS、 RTP均可阻滞 M吞噬 ManFITCBSA的作用, 且呈剂量依赖性(图 5、 6)。2.3 多糖刺激 M释放 TNF, IL4的测定采用 ELISA法检测细胞培养液中 TNF和 IL4水平, 体外将 APS和 RTP与 M共孵育 36 h, 可以促进正常腹腔 M分泌TNF(图 6), 与正常对照组相比有统计学意义（P0.01）; 两种多糖不能促进 M分泌 IL4的分泌, 与正常对照组相比无统计学意义(图 7); 甘露糖可完全阻滞 RTP诱导 M分泌 TNF, 对 APS诱导 M分泌 TNF只有部分对抗作用(图 8)。3 讨论我们已发现, RTP与 APS均具有免疫调节作用 , 但它的免疫调节机制目前尚不清楚。本实验证明 RTP、 APS均可抑制 M吞噬ManFITCBSA,提示 RTP、 APS的免疫调节作用可能通过 MR介8导。许多中药多糖富含甘露糖或葡萄糖, 且以反复串联的结构存在, 与 MR具有比 MRmAb更高的结合特性10 。如壳寡糖可通过 M表面的 MR, 产生白介素1 和 TNF11; 海带多糖能激活小鼠腹腔 M, 对 S180肿瘤细胞有较好的杀伤作用12 。我们的研究表明 RTP含有近 50%的甘露糖 , 而 APS则含有 N乙酰葡糖胺残基, 因此, RTP、 APS具有潜在的 MR结合特性。我们的实验结果表明, RTP与 APS均可以阻断 MR介导的 M吞噬作用, 且这种作用呈现剂量依赖关系, 为两种多糖作用于 MR提供了依据。为了进一步研究两种多糖与 MR的作用, 我们发现 RTP和 APS均可以促进 M分泌细胞因子 TNF, 而 MR的拮抗剂甘露糖可完全阻断 RTP刺激 M分泌 TNF的作用, 说明 RTP是通过 MR而起作用; 甘露糖则没有该作用; RTP和 APS对 M分泌细胞因子IL4无明显影响 , 揭示 RTP和 APS影响 M的免疫功能主要通过Th1型细胞免疫发挥作用, 同时提示我们以前实验中 RTP和 APS影响 T细胞极化可能通过 MR起作用。9【参考文献】1Cao W, Liu L, Mei Q, et al. Structural analysis of watersoluble glucans from the root of Angelica sinensis (Oliv.) DielsJ. Carbohydr Res, 2006, 341(11): 1870-1877. 2张 蓉, 刘 莉, 梅其炳, 等. 成人外周血来源的树突状细