1大鼠肺泡巨噬细胞原代培养技术的改良措施作者：何俊，徐文莉，曾思，曾因明，庞庆丰【摘要 】 目的 改良原代肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage, AM)培养技术，提高 AM 培养效果。方法 SD 大鼠，在体支气管灌洗肺获取 AM，通过预先注射空气、 14 号注射器针头回收灌洗液、低速离心、种板前多次吹打等改良措施分离和培养 AM。倒置显微镜连续观察 AM 的形态变化，台盼蓝拒染实验鉴定 AM 存活率，瑞氏-姬姆萨染色鉴定 AM 纯度。结果 AM 体外培养后 40 min 即见细胞贴壁;23 天时，细胞形态多样，呈圆形、不规则形、梭形等形态，胞体变大，胞质丰富。台盼蓝拒染实验示 AM 存活率95%，瑞氏-姬姆萨染色示 AM 纯度95%。结论 本实验改良了原代 AM培养的技术方法，提高了原代 AM 培养效果。 【关键词】 肺泡巨噬细胞;细胞培养;技术改良Abstract: Objective To modify the techniques for primary culture of highly purified the primary rat alveolar macrophages (AMs). Methods AMs were isolated in vivo and cultured with such modified techniques as pre-injection of air and reclamation of brochoalveolar lavage fluid with 14- bugle 2syringe needle, low-speed centrifugation and multi-blowing before plating on 6-well culture plates. The morphological changes were observed under the inverted microscope. The cell survival rate was detected with trypan blue dye exclusion test, and cell purity was determined by Wright-Giemsa staining. Results In vitro, AMs adhered to plastic surface within 40 min; 2-3 days later, cell morphology presented mixed shapes, i.e., circular, irregular and spindle shapes. The trypan blue test showed a survival rate 95% of the AMs and Wright-Giemsa staining indicated a purity 95% of the AMs. Conclusion The modified techniques employed in our experiment had better results for the isolation and primary culture of AMs.Key words: alveolar macrophage; cell culture; technique modification肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage，AM) 分布于呼吸道-肺泡表面，是肺部抗感染的第一道防线, 是肺部抵抗病原感染的重要组成部分。AM 不仅具有吞噬和抗原递呈功能，而且还能分泌多种生物活性物质,对急性肺损伤的发生、发展及转归具有重要影响1-3，因此，AM 一直是研究肺部抗感染模型的重要细胞类型。但由3于在分离培养原代 AM 过程中存在获取率低、混杂红细胞、容易污染损伤、不易贴壁等技术难题4，目前国内外研究者只能使用小鼠肺泡巨噬细胞株 MH-S5、大鼠肺泡巨噬细胞株 NR83836等细胞株替代原代 AM，然而 AM 细胞株与原代培养的 AM 在细胞形态、细胞活力及细胞生理等方面存在明显差异。因此，优化原代 AM 培养技术从而得到理想的 AM 对研究肺部感染性疾病发生机制有很重要的作用。本研究探讨 AM 培养技术的改良措施及注意事项。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 动物 健康雄性 SD 大鼠，体重 200250 g，由徐州医学院实验动物中心提供。1.1.2 主要试剂和器材 DMEM(低糖) 培养基( Gibco 公司 )，胎牛血清(杭州四季青有限公司 )，青霉素、链霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)，PBS( 北京中杉金桥生物技术有限公司)，台盼蓝染液(Sigma 公司)，瑞氏-姬姆萨染液(南京建成科技有限公司)，细胞培养箱(美国 Thermo Fisher Scientific )，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，倒置显微镜( 日本 Motic 公司)，离心机(美国 Beckman公司)。41.2 方法1.2.1 AM 的分离培养 在参考郭晓芳等7-8分离 AM 技术的基础上，我们对分离 AM 的方法加以改良。SD 大鼠以 10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，引颈处死;在 75%乙醇中浸泡消毒 12 min，移到超净工作台上，仰卧于小手术台上，固定头尾;打开胸腔，暴露肺; 暴露颈部气管，用 14 号注射器针头从颈部正中线切口行气管插管，用 4-0 的手术缝合线结扎固定 8-9。用冷 PBS 在体气管灌洗肺，同时按摩肺，每次 510 ml，灌洗 10 次，灌洗液回收率为 90%。灌洗液经 200 目细胞筛过滤，1 000 r/min 低速离心 10 min，弃上清，再用 PBS 洗涤 2 次，加入含 10%胎牛血清的 DMEM 培养液重悬沉淀细胞制成单细胞悬液。在倒置显微镜下进行细胞计数和台盼蓝拒染试验检测细胞活力，调整细胞密度为 1109 个/L ，将其接种于 6 孔培养板内。在 37、5% CO2 浓度的培养箱中孵育 12 h，弃上清，用 PBS 洗板 2 次去除非贴壁细胞，重新加入含 10%胎牛血清的新鲜 DMEM 培养基，继续放入培养箱内培养，23 天更换培养液。1.2.2 台盼蓝拒染实验 将 0.4 %的台盼蓝染液10与等体积单细胞悬液混合，染色 23 min ,取 1 滴混合悬液于细胞计数器内。镜下观察可见，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染，计数蓝染细5胞和未蓝染细胞。细胞存活率按以下公式计算:细胞存活率(%)=未染色细胞/(蓝染细胞 +未染色细胞)100%。1.2.3 瑞氏- 姬姆萨染色 取 5 l 单细胞悬液于载玻片上，制成涂片。待涂片晾干后，按瑞氏-姬姆萨染液试剂盒说明书操作。染色完成后，在倒置显微镜下观察细胞染色情况，鉴定单细胞悬液中AM 纯度。计算公式如下：细胞纯度(%)=着色巨噬细胞数/细胞总数100%2 结 果2.1 显微镜观察结果 单细胞悬液中 AM 呈圆形，透亮，培养 40 min 后可观察到呈椭圆形、三角形或不规则形的贴壁细胞，胞质丰富;2 h 后细胞贴满培养皿底部，细胞呈星形，有许多伪足和突起(图 1A);培养 23 天后，细胞形态多样，呈圆形、不规则形、梭形等形态，胞体变大，胞质丰富(图 1B)，此时细胞处于对数期，适合进行实验研究。图 1 AM 的形态学变化 (300)A.肺泡巨噬细胞贴壁 2 h;B. 肺泡巨噬细胞贴壁 2 天62.2 台盼蓝拒染实验结果 大多数细胞呈圆形透亮存活状态 ;极个别细胞破坏死亡，台盼蓝进入细胞核内呈蓝染状(图 2)。肺泡巨噬细胞的存活率95%。2.3 瑞氏- 姬姆萨染色结果 AM 胞质呈灰色，胞质颗粒呈细小淡紫红色，核呈紫红色;同时可见核呈紫红色、胞质呈浅红色并有淡紫红色颗粒的中性粒细胞。AM 细胞纯度95%(图 3)。图 2 肺泡巨噬细胞台盼蓝染色(400) 图 3 肺泡巨噬细胞瑞氏 -姬姆萨染色(600)3 讨 论目前原代 AM 培养在分离、培养过程中存在多种技术难题。在分离 AM 时，本实验运用了多种改良措施，获得了满意的效果：灌洗前一定要把肺内血液驱除彻底，减少灌洗液中红细胞数量，减少杂质;重悬细胞单细胞悬液时，要充分吹打细胞使之分散均匀，利于细胞贴壁;PBS 洗板及给细胞换液时，动作要缓慢，以免贴壁细胞脱壁，影响收集肺泡巨噬细胞的数量。为了保持培养的原代 AM 的活力， 在分离和培养环节中，本研究采取了以下措施:大鼠麻醉处死后到灌洗肺的时间应尽量缩短，以免时间过长影响细胞活力，整个过程要在冰浴上进行，放置7时间过长、温度过高将导致细胞死亡;大鼠浸泡乙醇消毒时，尽量在呼吸停止后浸泡，防止由于误吸乙醇破坏 AM;采用低速离心方法分离 AM，避免破坏细胞结构，影响细胞活力;AM 种板时加入10%胎牛血清可以促进细胞贴壁，增加细胞活力，促使细胞恢复其原来生理状态;在实验前去除血清，增加 AM 对药物的敏感性。另外，在培养细胞过程中，菌室和超净台要常规消毒，整个过程要注意无菌操作，防止细胞污染。 综上所述，本实验采用以上改良措施后，经台盼蓝拒染试验及瑞氏-姬姆萨染色方法鉴定，可以得到大量纯度高、活性好的 AM，为开展大鼠肺泡巨噬细胞的生物学功能及细胞生理、病理模型研究奠定了良好基础。【参考文献】1 Asehnoune K, Strassheim D, Mitra S, et al. Involvement of reactive oxygen species in Toll-like receptor 4-dependent acti-vation of NF-B J. J Immunol，2004,172(4):2522-2529.2 Foster SL, Hargreaves DC, Medzhitov R. Gene-specific control of inflammation by TLR-induced chromatin modificationsJ. Nature, 2007,447(7147): 972-978.3 Koay MA, Gao X, Washington MK, et al. 8Macrophages are necessary for maximal nuclear factor-B activation in response to endotoxin J. Am J Respir Cell Mol Biol,2002,26(5):572-578.4 盛金良，陈创夫，郑永峰，等.绵羊肺泡巨噬细胞的分离培养和形态学观察J. 石河子大学学报,2007,25(1):51-54.5 朱桂军，于占彪，李淑瑾，等. 二烯丙基三硫对脂多糖诱导小鼠肺泡巨噬细胞株 MH-S 细胞因子生成的影响 J. 中国急救医学, 2006，26(10): 680-682.6 张小宝, 朱敏敏,黄海慧，等. 氯胺酮对脂多糖诱发的大鼠肺泡巨噬细胞一氧化氮及氧自由基生成的影响J. 南京医科大学学报:自然科学版，2007，27 (10):1115-1117.7 郭晓芳.肺泡巨噬细胞体外培养及其在环境医学方面的应用J.医学研究通讯,1986,15(5):133-137.8 McCourtie AS, Merry HE, Farivar AS, et al. Alveolar macrophage secretory products augment the response of rat pulmonary artery endothelial cells to hypoxia and reoxygenation J. An