1天然的人源性核糖体展示抗体库的构建与初步鉴定【摘要】 目的 构建库容量大、多样性好的核糖体展示单链抗体（ScFv)库,为进一步筛选 ScFv 奠定基础。 方法 从健康自愿者的外周血淋巴细胞提取 mRNA,经 RTPCR分别扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)DNA,进而连接形成 ScFv DNA。将其连接TVector转化 E.coli JM109 大肠埃希菌，经蓝白筛选，挑取 9 个阳性克隆测序以鉴定 ScFv 组装。通过体外转录和翻译对抗体文库进行初步鉴定。 结果 VH、VL 和 ScFv DNA 分别约为 350、650 和1 100 bp。本试验成功构建 ScFv 核糖体展示模板。 结论 成功构建天然的大容量核糖体展示人源性 ScFv 文库,为下一步利用亲和富集筛选技术获得各类 ScFv 奠定基础。 【关键词】 抗体； 单克隆； 核糖体； 埃希氏菌属； 基因文库单链抗体(SingleChain fragment variant,ScFv)是通过基因工程技术方法把重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)连接而构建的重组蛋白，较之完整抗体具有分子量小、通透性高等特点，更适合用于药物靶向和免疫生物治疗。构建 ScFv 可通过传统的杂交瘤技术或噬菌体展示技术制备，而近年来问世的核糖体展示技术(ribosomal display，RD)是一种不受细胞转染和表达等因素影响的完全细胞外展示系统工程1，简化了 ScFv 的筛选过程，可望筛选到高亲和力2的 ScFv。本研究选用健康自愿者的外周血淋巴细胞为材料，构建天然大容量核糖体展示 ScFv 文库, 为下一步筛选各类 ScFv 奠定基础。1 材料与方法1.1 材料和试剂 mRNA 提取试剂盒（瑞典 Amersham 公司） ；Taq DNA 聚合酶，T4 DNA 连接酶，兔网织红细胞裂解液，T7 RNA 聚合酶，rNTPs RNase inhibitor（美国 Promega 公司） ；pMD18 TVector载体（日本 Takara 公司） ；RNA 抽提试剂盒（瑞士 Roche 公司） ；脂多糖（LPS，美国 SigmaAldrich集团公司） 。1.2 方法1.2.1 mRNA 提取和 RTPCR 抽取 10 位健康志愿者外周血，其中男性 5 例，女性 5 例，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。按mRNA 提取试剂盒 (Amersham)说明书所述步骤提取 mRNA。以Oligo(dT)为引物逆转录合成第一链 cDNA，具体方法按说明书进行。1.2.2 ScFv DNA 的构建及扩增 利用 mRNA 反转录合成 cDNA第 1 链，以第 1 链为模板,扩增抗体基因按文献扩增人类主要的轻重3链可变区基因，所有引物序列根据抗体两端相对保守的框架区设计23。所需引物和寡核甘酸均由上海生工负责合成。扩增重链 VH 可变区引物为：VH/T7（上游）： 5GCAGCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCACCATGAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG3VH2（下游）： 5TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC3其中划线部分为 T7 启动子序列；黑体部分所示为核糖体结合位点。扩增 VL 可变区引物为：VL（上游）：5ATTGAGCTCACCCAGTCTCCA3Ck（下游）：5GAACACTCATTCCTGTTGGAGCT3引物中的简并碱基符号 M=A/C,R=A/G,S=C/G,W=A/T，按程序 1(30 个循环:94 1 min55 2 min72 2 min)进行PCR，分别扩增 VH 和 VL cDNA ,对扩增产物进行纯化并测定其浓4度。Linker 序列为(Gly4Ser)3，该引物两端的各 18 个碱基分别与VH 和 VL 基因的 3端和 5端相互补。将 VH、VL 和 Linker 等量混合后,经程序 2(7 个循环: 94 1 min63 4 min)进行聚合反应使 VH 和 VL 籍 linker DNA 连接形成 ScFv DNA。然后通过引物 VH2 和 CK 进行 PCR 扩增,执行程序 1，使聚合的 ScFv DNA 得到扩增。1.2.3 核糖体展示抗体库的构建 将最后纯化的核糖体 ScFv 展示模板连接 TVector，用 Bio Rad 电转化仪将连接产物转化入 E.coli JM109,通过蓝白筛选 ,随机挑取 9 个克隆子，进行菌落 PCR 法验证。将验证阳性的克隆子测序，分析序列，以此评价文库序列的多样性。1.2.4 核糖体展示抗体库的初步鉴定 将 PCR 扩增的随机 ScFv DNA 文库进行离体转录（终浓度/100 L：1转录 Bufffer、10 mmol/L DTT、100 U RNase inhibitor、0.75 mmol/L rNTPs、40 U T7 RNA 聚合酶、2 g随机 DNA 文库） ，37 反应2 h，回收 mRNA。转录产物再用兔网织红细胞裂解液系统进行离体翻译（50 L的体积加入兔网织红细胞裂解液 35 L、1 mmol/L不含亮氨酸的氨基酸复合物 0.5 L、1 mmol/L 不含甲硫氨酸的氨基酸复合物 0.5 L、40U RNase 抑制剂 1.0 L、mRNA 2 g）30 培育 30 min，于冰上放置。5将体外翻译完成的产物立即从 30 拿出，加入冰冷的 PBSMB溶液，轻轻混匀后，加入已用 LPS 封闭好预冷的酶联板中，每孔 50 L，冰上放置 12 h。用 PBSTM（1PBST 缓冲液中含 5 mmol/L MgCl2）冲洗 3 遍，每次 5 min，然后用 PBSM（1PBS缓冲液中含 5 mmol/L MgCl2）冲洗 2 遍，每次 5 min。加入 EB缓冲液(1PBS 缓冲液中含 20 mmol/L EDTA)，冰上放置 10 min，吸取上清。重复此步骤 1 次。将收集的上清用 RNA 抽提试剂盒(Roche)提取上清中的 RNA，引物 VH/T7 和 Ck 反转录扩增RNA 得到一轮筛选后的 ScFv DNA 文库。将 DNA 文库又进行体外转录、翻译、筛选，重复 2 次。得到 3 次筛选后的 ScFv DNA 文库。分别以回收的 RNA 为模板进行 RTPCR。2 结 果2.1 VH、VL 及 ScFv DNA 的扩增结果 扩增得到的 VH 和 VL DNA 分别约为 350 bp 和 650 bp，VH、 VL 和 linker 连接后的ScFv 片段大小为 1.1 kb 左右。将大量扩增的 ScFv DNA 通过琼脂糖凝胶电泳回收纯化，保存于-20 （图 1） 。2.2 核糖体展示 ScFv 文库的构建及分析 将菌落 PCR 验证为阳性的 9 个克隆子测序。结果表明，克隆的 9 条 ScFv 序列都是完整的，为开放阅读框，内部没有终止密码子。通过 VBASE DNAplot 6软件分析 9 条 ScFv 序列，其重链分别属于VH1，VH3，VH5 ，VH4 基因家簇，轻链分别属于VK，VK，VK亚基因家簇。根据 Kabat 软件分析，9 条序列的重链和轻链 CDRs（互补决定区）也均有不同程度的变化。2.3 核糖体展示 ScFv 文库的初步鉴定 将每轮回收得到的 RNA各取 2 L进行 RTPCR扩增，扩增结果见图 2。从图中可以看出，第一轮筛选后回收的 mRNA 进行 RTPCR扩增，得到一条非常微弱的条带。而经过 3 轮筛选后，得到非常明亮的扩增条带。3 讨 论RD 是蛋白质筛选的重要工具，已用于筛选配体、受体，确定抗原表位，开发新的蛋白酶抑制物和新的药物等。该技术的特点是：正确折叠的完全蛋白和编码它的 mRNA，同时结合在核糖体上，利用抗原抗体特异性结合的特点，便于蛋白富集，便于抗体文库筛选，是一种无细胞系统的蛋白质改造技术，可分为真核和原核 RD。真核系统较原核系统有一定的优越性，原核系统受内源 RNase 的影响较大，生成的 mRNA 容易降解，而真核系统受内源 RNase 的影响较小。另外真核系统有利于提高某些蛋白质的翻译和折叠效率4。因此在本研究中笔者采用真核 RD。核糖体展示完全在体外进行，弥补了噬菌体展示、细菌表面展示、酵母表面展示)等细胞内展示的7不足，显著增强了库容量及分子多样性，库容量可以达到10131015，比噬菌体展示文库( 约 109)提高了 104106 倍5。有研究表明合理的 ScFv 应有一个连接 VH 和 VL 的柔性序列，通常是(Gly4Ser)3,而且 VH 和 VL 两功能域的排序应是 VH 在上游，VL 在下游。否则，ScFv 不仅活性极差，而且难于诱导免疫应答6。鉴于此，笔者所构建的 ScFv 也按上述顺序排列。互补决定区(CDRs)在抗原抗体特异性结合方面起着重要作用，CDRs 的多样化意味着不同抗原特异性多样化。从实验结果可以看出，所构建的 ScFv DNA文库序列是完整而多样的，可用于进一步进行特异性抗原的筛选。在本实验中，以 LPS 作为抗原进行了三联复合体的筛选。经过 3 轮筛选后扩增得到的 DNA 条带明显比只经过一轮筛选后扩增的 DNA条带强，说明在 RD 过程中，能与 LPS 特异性抗原相结合的 ScFv基因得到了显著的富集。表明构建的核糖体展示文库是成功的，为进一步的 ScFv 筛选奠定了坚实的基础。【参考文献】1 Christian Z,Patrick A, Andreas P. Ribosome display selecting and evolving proteins in vitro that specifically bind to a targetJ. Nature Methods, 2007（4）:269279.2 黄开红，李学先，陈茵婷，等. 大容量核糖体展示抗体库的构8建与初步鉴定J.中国实用内科杂志 , 2007,27（18）:14651469.3 吴红艳，章晓联，潘 勤. 利用核糖体展示文库初步筛选与伤寒杆菌型纤毛结合的细胞受体J. 生物技术通讯 , 2004,15（4）:319322.4 Levin A M, Weiss G A. Optimizing the affinity and specificity of proteins with molecular displayJ. Mol Biosyst, 2006(2):4957.5 Smith G P, Petrenko V A. Phage displayJ. Chem Rev, 1997, 97(2):391410.6 朱 毅,朱 进,冯振卿, 等. 日本血吸虫单克隆抗抗独特型抗体NP48 单特异性双链抗体的构建表达与初步鉴定J. 中国血吸虫病防治杂志, 2005,17(4):241245.