肿瘤坏死因子临床应用的新探索詹军伟 2008 级 生物技术（2）班 20082170219摘要：种瘤坏兄因子具有多种生物学活性，对种瘤细胞有强烈的杀伤作用，使其有可能成为临床上有一定应用价值的杭疮生物制剂。但同时也存在一定的毒副作用，限制了其临床应用。近年来，国内外学者对种瘤坏死因子及肿瘤坏死因子受体的结构与功能关系进行了深入研究并取得了一些进展，为在分子水平改建种瘤坏死因子提供了理论依据，使之有可能减少其毒副作用，而保持其抗瘤活性。关键字：肿瘤坏死因子 TNF TNF 抗瘤疗法 免疫调节 TNF 受体肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)包括 T N F-a 和 TNF-S 二类。T N F-a 是由激活的单核巨噬细胞所产生，而 TNF-a 则是由活化的 T 细胞所分泌。研究表明， TNF 除具有强烈的杀伤肿瘤细胞作用外，且参与免疫调节，与炎症、休克、发热、多器官功能衰竭及恶病质等均有密切关系。作为一种潜在的抗肿瘤生物制剂，人 TFN-a 已进入临床试验，但试验表明，TNF 有严重毒副作用。克服这些毒副作用是 TNF 用于临床的前提，为此，国内外许多学者开展了有关优化 TNF 抗瘤疗法的研究。TNF 基因疗法能在一定程度上克服TNF 的毒副作用，但还存在一些问题有待解决。近年来，在 TNF 及 TNF 受体结构与功能关系的研究方面取得了一些进展，为利用基因工程和蛋白质工程技术改建 TNF 提供了理论依据，也为 TNF 的临床应用提供了一条新途径。一、TNF 的结构与功能1,TNF 的基因结构1984 年，Pennica 等首次分离、表达了人 TNF-a cDNA，同年，Grayp 等分离、表达了人 TNF-S cDNA o TNF-a 和 T N F-P 基因均位于人的第 6 号染色体，而小鼠则位于第 17 号染色体，两个基因紧密连锁。其基因结构有相似之处，也有不同之点。每个基因约有 3 000个碱基对，都有 4 个外显子和 3 个内含子。第 4 个外显子高度同源，提示这两个基因来自一个共同的祖先 1。但 T N F-a 和 TNF 日基因的前 3 个外显子和内含子都是不同源的，调节基因复制的 5端也有很大区别，又说明这两个基因是不同的。2,TNF 的蛋白质结构人 T N F-a 和 T N F-S 分子的氨基酸有 28%同源。人 TNF-a 分子有 2 种形式，一种是由 233 个氨基酸组成的 26kD 膜结合型，切去 76 个氨基酸的跨膜区后，转变成 17kD 分泌型 TNFo 26kD 及 17kD 的人 T N F-a 在体内外均有细胞毒活性 2。人 TNF-s 分子由 205 个氨基酸组成，切去 34 个氨基酸的信号肤后，转变为成熟型 TNF-P.3,TNF 分子中活性位点的确定TNF 分子中单个氨基酸的替换可对其生物学活性产生不同的影响。当诱变人 TNF-a 下列区域的氨基酸(32,36,86,84,29,146,91)时，人 TNF-a 的细胞毒活性明显下降，但不改变其理化特性 3。表明这些位点的氨基酸可能参与了人 T N F-a 与受体的结合并同时启动人 T N F-a 介导和细胞毒活性，是人 T N F-a 分子结构中非常重要的部分。4,TNF 分子 N 端及 C 端的重要性对人 TNF-a N 端氨基酸的缺失试验表明，去除 N 端 7 个氨基酸可增强其抗瘤细胞毒活性。去除 8 个氨基酸时其抗瘤细胞毒活性降至与野生型 T NF 相同。当从 N 端去除 10 个以上氨基酸时，其抗瘤细胞毒活性明显下降 4。而人 T N F-p 则在去除 N 端 27 个氨基酸时还不丧失其细胞毒活性 5。提示人 TNF-a N 端的 9 个氨基酸及人 TNF-p N 端的 27 个氨基酸虽非其功能所必需，但在某些方面能够调节修饰人 T N F-a 和 TNF-p 的生物学活性。相反，人 TNF-a C 端对其生物学活性非常关键，可能是受体结合位点的一部分，当去除 C 端 3 个氨基酸时可使其细胞毒活性明显下降 6。而人 T N F-p 在去除 C 端 10 个氨基酸时可导致其生物学活性的丧失 7。二、TNF 受体的结构与功能1,TNF 受体的结构TNF 受体(TNF Receptor,TNFR)存在于多种正常细胞及肿瘤细胞表面。蛋白质纯化及基因克隆技术表明，TNFR 有 55kD 和 75k D 二种类型。T NFR-p 55 主要存在于对 TNF 细胞毒活性敏感的细胞上，而 TNFR-p75 则主要表达在骨髓来源的细胞及经过刺激的 T,B 细胞上187。这二种类型的 TNFR 均由信号肤、胞外结构区、跨膜区和胞内结构区四部分组成。它们的胞外结构区很相似，但它们的胞内结构区差别很大，提示它们在细胞内信号传递上存在差异 92,TNFR 的功能TNF 的生物学活性是由 TNFR 介导的。最近用抗 TNFR 单克隆抗体及突变型 TNF 研究两类 TNFR 在介导 TNF 生物学活性中的作用方面取得了一些进展。但对两类 TNFR 的生物学功能是否有分工及如何分工，目前尚无一致意见。大多数学者认为，这两类 TNFR 在介导 TNF 生物学活性中有分工，TNF 的细胞毒活性是由 TNFR-p55 介导的 8-11。其中Ostade 等 12认为 TNFR-p55 介导 TNF 的抗瘤细胞毒活性，TNFR-p75 则介导 TNF 在抗瘤治疗中的毒副作用。但也有的学者认为，两类 TNFR 没有分工，TNF 的细胞毒活性是由二类TNFR 共同介导的 12三、TNF 的基因疗法由于 TNF 用于治疗时可引起全身性毒副作用，因此人们设想，将 TNF 基因导入运载细胞，再将运载细胞输入体内，通过其聚集在肿瘤局部分泌一定量的 TNF，既可发挥 TNF的抗瘤效应，又可避免 TNF 引起的全身毒副作用。目前，肿瘤的 TNF 基因疗法方案有二种。1,TNF 基因导入免疫细胞以增强其免疫杀伤效应1993 年 Hwu 等 13首次将 TNF 基因导入 T IL 细胞，与未转染的 T IL 细胞比较，转染细胞产生大量 TNF，但与相同条件下转染的肿瘤细胞相比产量很低。随后，Tashiro 等 14将 TNF 基因导入 LAK 细胞，使 LAK 细胞膜表面 TNF 呈阳性，分泌量增加，细胞毒活性增强。2,将 TNF 基因导入仲瘤细胞以诱导机体免疫系统产生更有效的免疫应答Asher 等 15证实局部的 TNF 高浓度可在宿主没有毒性反应的情况下导致肿瘤消退。1992 年 Rosenberg 等 16用 TNF 基因转染自身肿瘤细胞，然后收集引流部位的淋巴细胞，经体外加 IL-2 培养扩增后回输给病人。期望通过遗传工程技术使肿瘤细胞额外产生 TNF，刺激局部的淋巴细胞和趋化全身其它部位的淋巴细胞到达肿瘤部位，增强免疫杀伤作用，但临床效果不佳。试验表明，野生型 TNF 基因在肿瘤细胞中表达相当容易，但在淋巴细胞中的表达还存在困难。Hwu 等 13报道，转录及翻译水平的障碍限制了转入淋巴细胞的 TNF 基因的表达。但用野生型 TNF 基因转染肿瘤细胞，如果 TNF 的分泌量过高达到一定的血清浓度，除了出现 TNF 的抗瘤效应外，也能导致全身性毒副作用的发生 17,18。四、TNF 突变型随着对 TN F 及 TNFR 结构研究的深入，人们通过定点突变及缺失突变的方法从不同角度探讨 T NF 结构与功能的关系，以期望利用基因工程及蛋白质工程技术改建 TNF 分子。最近，国内外一些学者报道已构建出一些 TNF 突变型，其抗瘤活性增强，毒副作用降低，为 TNF 的临床应用带来了希望。这里仅从二个方面介绍 TNF 突变型。 1、受体选择性 TNF 突变型TNF 的生物学活性是通过 NTFR 介导的。当 TNF 与 TNFR 结合后即内化并降解，产生一系列细胞内信号，导致不同的生物学活性。虽然目前对两类 TNFR 是否有分工及如何分工尚无一致意见，但二者细胞内结构差别很大，几乎可以肯定它们在细胞内信号 传递上存在差异。由于多数学者认为 TNF 的细胞毒活性是由 TNFR-p55 介导的，因此 研究者们主要致力于改建能选择性地与 TNFR-p55 结合的 TNF 突变型。已报道有些 TNF突变型能选择性地结合 TNFR-p55,而与 TNFR-p75 的亲合力很低a-io 。人们希望这些 TNF突变型用于临床治疗时能突出其抗瘤效应，而同时尽可能地降低其毒副作用。2、不分泌性 TNF 突变型Kriegle 等 2首先发现，人 T N F-a 有两种形式，即 26k D 膜结合型及 17kD 分泌型。一认为这两种形式的人 T N F-a 均有细胞毒活性。此后，另一些学者发现 14-19膜结合型 TNF在杀伤 TNF 敏感的靶细胞中起主要作用。1990 年，Perze 等 20通过缺失突变人 T N F-a 得到一个仅表达在细胞膜表面、不分泌的 TNF 突变型。他们用这种不分泌的 TNF 突变型基因转染 NIH3T3 细胞发现，这种不分泌的 TNF 突变型能杀伤肿瘤细胞及 病毒感染细胞，且能将其作用局限在靶细胞附近而不引起 TNF 分泌所导致的全身性毒副作用。因此人们设想，如果将这种 TNF 突变型用于基因治疗，既可增强抗瘤效应，又可以克服 TNF 分泌量过高引起的毒副作用，有可能解决野生型 TNF 基因用于基因治疗中所存在的一些问题。结语自从 1975 年 Carswell 等首次发现 TNF 以来，经过大量的研究，人们对它的认识已逐渐完善。尽管人 T N F-a 的临床试验已取得一些令人振奋的结果，但由于其毒副作用限制了它的临床应用。TNF 基因疗法能在一定程度上克服 TNF 的毒副作用，但还存在一些问题有待解决。因此，人们对 TNF 及 TNFR 的结构与功能进行了深入研究，目的在于要在分子水平改建 TNF。最近，国内外许多学者报道已构建出一些 TNF 突变型，其抗瘤活性增强，毒副作用降低，给 TNF 的临床应用提供了一条新途径。相信在不久的将来，人们一定能够获得一些理想的 TNF 突变型并用于临床。参考文献1 Paul NL et al. Ann Rev Immunol, 1988;6:4072 Kriegler M et al. Cell，1988;53:453 Ostade XV et al. The EMBO Journal, 1991;10:8274 Creasey AA et al. Cancer Res，1987;47:1455 Wakabayashi T et al. The Journal of Biological Chemistry, 1990;265:76046 Gase K et al. Immunology, 1990;71:3687 Kabayashi Y et al. J Biochem, 1986;100:7278 Ostade XV et al. Nature, 1993;361:2669 Loetscher H et al. The Journal of Biological Chemistry,1993;268:2635010 Barbara JAJ et al. The EMBO Journal，1994;13:84311 Tartaglia LA et al. Cell, 1993;73:21312 Heller RA et al. Cell, 1993;73:21613 Hwu P et al. The Journal of Immunology, 1993;150:910414 Tashiro T et al. J Neurosurg, 1993;78:25215 Aaher AL et al. The Jo