血管内皮生长因子与肿瘤治疗的研究进展【摘要】肿瘤生长和转移依赖于血管生成,肿瘤血管生成是受多种细胞因子、生长因子及其受体调控,其中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)被认为是最关键的调控因子, 以VEGF 及其受体作用途径中的任一环节为靶点,阻断 VEGF 对肿瘤血管的作用,都可以达到遏制肿瘤生长和转移的目的。VEGF 靶向抗肿瘤血管生成成为抗肿瘤的新策略。【关键词】VEGF 肿瘤 靶向治疗 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),也叫做血管通透因子(vascular permeability factor,VPF),在正常胚胎发育时有广泛的表达,但正常成年者的组织中呈低水平表达,在肿瘤等病理情况下其表达异常升高。VEGF 是一种高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂因子,通过与其特异性受体(VEGFR)结合,引起一系列的信号转导 ,释放多种细胞因子与生长因子,刺激血管内皮细胞增殖和迁移,促进新生血管生成,在肿瘤的生长和转移中起重要作用。1VEGF 生物学功能VEGF 的功能包括:诱导内皮细胞钙浓度短暂升高、形态改变、分裂及运动,影响内皮细胞基因表达,加快基底膜降解,从而发挥促血管生成功能。增加血管通透性,使血浆蛋白外渗,形成血管化纤维蛋白基质,为内皮细胞迁移形成网架。血管内物质外漏也为肿瘤转移提供基质,这对于肿瘤发展和转移可能比促内皮细胞增生更重要。另外,肿瘤细胞分泌的 VEGF弥散作用于肿瘤周围组织的毛细血管,使其通透性增加造成瘤周水肿。改变内皮细胞基因表达,诱导其合成大量蛋白水解酶,加速血管构建。抑制宿主抗原呈递细胞成熟,使肿瘤细胞得以逃避免疫监视。诱导血管内皮细胞 bcl-2 基因表达,提高诸如放射损伤细胞、血管内皮细胞抗凋亡的能力。2VEGF 促进肿瘤生长、侵袭、转移的机制肿瘤的侵袭、转移涉及到多个步骤:包括在局部生长到一定大小后瘤细胞从原发灶脱落,细胞外基质和基底膜的降解,瘤细胞进入血循环后逃脱宿主的免疫监控而存活下来, 瘤细胞达远处组织器官后粘附, 继而新生血管形成, 最后继发成瘤。 VEGF 几乎参与了此过程中的各个步骤，而不仅仅只作为促血管生成因子和血管通透性因子。21 VEGF 通过对内皮细胞的增殖、迁移、粘附的调节而促进新生血管的形成。22 肿瘤细胞分泌的 VEGF 通过自分泌机制与瘤细胞上的 VEGFR-2(KDR)结合，调控下游基因的表达而促进瘤细胞的生长、侵袭、转移。23 VEGF 通过抑制树突细胞的分化、成熟，减少树突细胞的生成从而降低宿主免疫功能。3VEGF 肿瘤治疗中的应用31 基因治疗 311 反义寡核苷酸 反义寡核苷酸可抑制 VEGF 基因水平的分泌,也可特异性降低细胞中 VEGFR mRNA 水平。高渝等利用超声微泡介导 VEGF 反义寡核苷酸转染作用于人膀胱癌裸鼠移植瘤模型，能够有效下调人膀胱癌裸鼠移植瘤组织 VEGF 的表达，减少肿瘤组织新生血管的生成，继而导致肿瘤细胞凋亡增加而增殖减少，最终达到抑制肿瘤生长的效应 【1】 。王颖等的实验表明,VEGF 反义寡核昔酸局部注射能够抑制小鼠肺癌的生长。小鼠接种完 lewis 肺癌细胞后，用 VEGF 反义寡核昔酸 (ASODN) VEGF 正义寡核昔酸(SODN)皮下注射进行治疗并对比，结果显示 VEGF 反义寡核昔酸是 VEGF 正义寡核昔酸抑制肺癌组织生长作用的 8 倍 【2】 。312 RNA 干扰 以 VEGF 基因为靶向的短发夹 RNA(short hairpin RNA, shRNA)真核表达质粒,通过RNA 干扰技术沉默血管内皮细胞中 VEGF 基因的表达，费春梅等采用 DNA 重组技术根据大鼠 VEGFmRNA 序列设计并合成 3 条 shRNA 寡核苷酸片段,构建表达质粒并通过脂质体介导转染大鼠主动脉血管内皮细胞 ECs,采用 RT-PCR,Western Blot 方法分别检测 VEGF mRNA 及蛋白质的表达。 3 条 VEGF shRNA 质粒均可下调 VEGFmRNA 和蛋白的表达 【3】 。32 阻止 VEGF 与其受体的结合321 抗 VEGF 和 VEGFR 抗体利用 VEGF 或 VEGFR 的单克隆抗体与 VEGF 或 VEGFR 结合,阻断 VEGF 与受体的结合,达到抑制其促进血管生长的作用,发挥抗肿瘤的效应。对于已表达的 VEGFR 可以利用抗 VEGFR 单克隆抗体与其结合,阻断信号传导通路,达到抑制血管生成的目的。目前针对 VEGFR-1 研究较多的是其单克隆抗体 DC101。抗 VEGF 抗体贝伐单抗(Bevacizumab)为一种重组人源化 IgG1 型单克隆抗体。轻链可变区由鼠源部分组成,能与 VEGF 结合,重链固定区和大部分轻链区为人源部分。Bevacizumab 与 VEGF-A 结合抑制 VEGF-A 与其受体的结合而发挥作用,但其不结合PIGF、 VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D。曹梦苒等的关于 IFL(irinote-can, fluorouracil 和leucovorin)联合贝伐单抗 (5mg/kg)方案用于晚期结直肠癌一线治疗的临床试验,显示该联合方案增加了肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,有效延长了患者的生存期。贝伐单抗与 IFL 方案联合应用,较单用 IFL 方案化疗可以明显提高治疗的有效率(448%vs34 8% ),延长TTP(104 个月 vs71 个月) 、无进展生存期(PFS, 106 个月 vs62 个月) 和中位生存期(OS,203 个月 vs156 个月 )【4】 。美国 FDA 已经把它与氟尿嘧啶和伊立替康联合化疗作为治疗转移性直结肠癌的一线药物，而其在转移性乳腺癌、肾癌、非小细胞肺癌等肿瘤的临床试验中也显示了较好的治疗效果。此外还有 VEGF 的单克隆抗体 3E7、GV39M 、2C3等都是抑制肿瘤血管生成的候选药物。322 VEGF 受体的抑制剂VEGF 受体阻断剂可与 VEGF 受体结合,进而阻止其与 VEGF 作用,也起到抑制 VEGF的作用。此类药物包括: SU5416、SU6668、ZD4190、ZD6474 、ZK222584 、CD547 、632、SU11248 等。ZK222584又称为 PTK787,是 Novartis 公司研发的一种有效的选择性针对 VEGF-2 受体 KDR 和 Flt- 1激酶的抑制剂。它可以抑制 VEGF 诱导的 VEGFR-2(KDR)自磷酸化作用,从而抑制血管内皮细 h 胞的增殖、迁移,肿瘤内部微血管的形成,达到抑制肿瘤生长和转移的目的。SU5416 是一种 VEGFR-2(Flk-1/KDR)酪氨酸激酶的抑制物,在肿瘤异种移植模型中,SU5416 可以通过抑制肿瘤血管形成,从而抑制多种不同起源肿瘤的生长。323 VEGF 片段VEGF 片段作为其抑制剂是具有极大潜能的,分离出的来自于 VEGF 外显子 6 的含 12个氨基酸的肽能抑制 VEGF 与 HUVECs 结合和 VEGF 诱导的有丝分裂、细胞迁移、内皮细胞存活、ERK 激活和前列环素的产生。在体外引起明显的血管生成抑制作用,并且认为这种肽的血管生成抑制作用至少部分地是通过抑制 VEGF 与 VEGFR-2（KDR ）的结合。研究证实 VEGF189 的外显子 6 编码的多肽片段 QKRKRKKSRYKS 能与特异结合,但并不激活KDR 的酪氨酸激酶活性, 从而竞争拮抗 VEGF 的促血管生成作用。秦浙学等选择该多肽进行 188Re 标记进行肿瘤显像,不仅可以避免标记完整 VEGF 分子的繁琐技术,又可以避免完整VEGF 促肿瘤血管生成的活性。因此,多肽 QKRKRKKSRYKS 有望作为放射性核素标记进行肿瘤显像及治疗的生物分子 【5】 。可见,用 VEGF 片段进行抗肿瘤治疗是一项可行的策略。324 可溶性受体可溶性 VEGFR 由受体的胞外区剪接而成,具有可分泌性,但组织中自然分泌者较少,属于稀有剪接形式。其拮抗 VEGF 作用是通过形成异二聚体,即显性阴性突变型来实现的。 现证实可溶性 VEGFR 仅具有与配体结合的能力,而无信号传导功能,因此可竞争 VEGF 的功能受体,阻止肿瘤血管的形成,进而抑制肿瘤生长。可溶性受体 sFlt-1 由 VEGFR-1(Flt-1)蛋白的胞外前 6 个结构域加上 1 个特异性 31 氨基酸尾部组成,是 Flt-1 的 mRNA 经交替拼接生成,在正常角膜中亦有表达,可以高亲和中和抗体的形式与内源性 VEGF-A 结合,阻断其信号传导,抑制其促血管化作用 【6】 。寇伯君等应用 RT-PCR 技术 ,将可溶性 VEGFR-2 片段克隆入逆转录病毒载体 PLXSN 并成功转染肿瘤细胞系 S180 和 B16,体内实验显示,转基因细胞系的瘤重减轻,体积明显缩小,且其血管密度明显降低,而 KDR 蛋白表达明显增高 【7】 。33 VEGF 信号转导阻断剂VEGF 与受体结合后将产生受体自磷酸化等一系列信号转导,通过阻断转导途径,也可达到抑制 VEGF 作用的目的。VEGFR 与 VEGF 结合后,首先要通过酪氨酸激酶活化,诱导自身磷酸化和转磷酸化,才能触发信号传递。因此,抑制受体的酪氨酸激酶活性将会阻断信号传递过程。目前有不少针对 VEGF 及其受体结合一系列信号转导方面的药物已经进入临床。索拉非尼是一种多靶点的抗肿瘤药物,它具有双重的抗肿瘤作用,一方面通过抑制RAF/MEK/ERK 信号传导通路直接抑制肿瘤生长; 另一方面通过抑制 VEGF 和血小板衍生生长因子(PDGF) 受体而阻断肿瘤新生血管的形成,间接地抑制肿瘤细胞的生长。2008 版美国国立综合癌症网络（NCCN）指南已将索拉非尼列为晚期肝癌（HCC）的一线治疗药物。另一种广谱的酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼（Sunitinib）能够抑制 VEGFR-2、VEGFR-3 和VEGFR-1 以及血小板衍生生长因子(PDGFR- ) 、KIT、Flt-3 和 RET 的酪氨酸激酶活性,通过特异性阻断这些信号传导途径达到抗肿瘤效应。已于 2006 年 1 月获得 FDA 批准，2007年 11 月获得 SFDA 批准，适应证为胃肠间质瘤（GIST ）和晚期肾癌 【8】 。34 以 VEGF 为中介的导向治疗将 VEGF 与小分子毒性物质结合后,通过 VEGF 与肿瘤血管内皮细胞及肿瘤表面受体的特异性结合,发挥抑制血管形成及杀瘤效应。白喉毒素分子 DT390 可分别与 VEGF 165 和VEGF 121 结合均可抑制表达 VEGFR 的人脐静脉内皮细胞及卡波西肉瘤细胞的生长,而对不表达 VEGFR 的主动脉平滑肌细胞、成纤维细胞和 B 细胞则无毒性作用。两者均有明显抑制肿瘤生长的作用。总结与展望随着分子生物学技术的不断深入发展, VEGF 的结构和功能将会日益明确。如上所述, 血管内皮生长因子(VEGF)是目前发现的最重要的促进肿瘤血管形成的因子。随着靶向血管治疗肿瘤新策略的倍受关注,可以通过抑制 VEGF 及其受体的表达;阻止 VEGF 与其受体的结合; 阻断 VEGF 与其受体结合后的信号传递等可抑制肿瘤生长。应用与 VEGF 有关的方法治疗肿瘤的安全性以及这些方法的临床可行性和实用性等还需要进一步研究。例如，抗 VEGF 药物最常见的是贝伐单抗。贝伐单抗最常见的 3 种不良反应为高血压、出血和血栓形成。有高血压病史的病人用贝伐单抗治疗时更易引起高血压,可口服抗高血压药物治疗 【9】 。一些临床研究表明，单一的治疗方向只能起到抑制肿瘤血管生成的作用,停药后肿瘤可能容易复发,各种方法联合应用会比单独一种治疗方法更有效：联合应用抗血管基因治疗和化疗,不仅可以提高疗效,而且有助于降低瘤细胞的耐药性；同时抑制两种或多