1抗凋亡基因 Bag-1 和 Bcl-2 在结肠癌组织的表达及相互关系的研究作者：孙念峰张建良王国斌【摘要 】 目的：研究抗凋亡基因 Bag-1 和 Bcl-2 在结肠癌组织中的表达及意义，并探讨二者之间的关系。方法：应用免疫组织化学 SABC 法（链霉亲合素- 生物素-过氧化物酶复合物法）对 128 例结肠癌组织及 20 例正常结肠组织中 Bag-1 和 Bcl-2 基因的表达进行检测。结果：Bag-1 和 Bcl-2 在结肠癌中的表达与结肠癌病理类型、肿瘤直径、浸润深度及有无淋巴结转移无关，但 Bag-1 与病理分级、远处转移、Dukes 分期及预后密切相关（P0.05） ；Bag-1和 Bcl-2 在结肠癌的发生发展过程中呈正相关（r=0.475） 。结论：结肠癌组织中有不同水平的 Bag-1 和 Bcl-2 蛋白的高表达，两者相互作用并可以作为结肠癌早期筛选的一项指标，对疾病的预后有重要意义。 【关键词】 大肠肿瘤 Bag-1Bcl-2细胞凋亡【ABSTRACT】Objective: To investigate the expressions of Bag-1 and Bcl-2 in colorectal cancer and evaluate their 2clinical significance. Methods: Bag-1 and Bcl-2 expressions were studied by immunohistochemical Streptavidin-Biotin-Peroxidase Complex (SABC) method in 64 samples of colorectal cancer tissues, 10 normal colorectal tissues. Results: Bag-1 was positively related to the tumor grade, distant metastasis, stages of Dukes and prognosis, but was not related to the pathological cell types, tumor diameter, depth of invasion and lymph node metastasis. Bcl-2 was 结肠癌是人类胃肠道最常见的恶性肿瘤之一，且发病率有逐年上升的趋势。细胞凋亡障碍是肿瘤发生的重要机制之一，目前研究表明凋亡是一个受多基因控制的过程1 。Bag-1 是最近发现的一种多功能结合蛋白，具有与抗凋亡基因 Bcl-2 相互结合、相互影响从而促进细胞抗凋亡的能力1-4 。 Bag-1 在肿瘤发生发展中的作用已成为国内外研究的热点问题之一。本研究采用免疫组织化学法检测 Bag-1 和Bcl-2 在结肠癌组织中的表达情况，并就其临床意义及相互关系进行初步探讨。1资料与方法1.1一般资料收集 2004 年 1 月2007 年 12 月手术切除的结肠癌石蜡包埋组织块 128 例，为华中科技大学同济医学院附属协和医院病理科存档标本 91 例和山东大学第二附属医院病理科存档3标本 37 例，均经 4%多聚甲醛灌注固定，常规石蜡包埋连续切片，厚约 5 m。年龄 3774 岁。按世界卫生组织（WHO）病理分级，腺癌 92 例（其中高分化腺癌 36 例，中分化 36 例，低分化 20 例） ，黏液癌 20 例，未分化癌 16 例。按 Dukes 临床病理分期，A 期 44例，B 期 38 例，C 期 28 例，D 期 18 例。同时选择 20 例正常结肠组织石蜡标本作为对照组。1.2实验试剂主要试剂有兔抗人多克隆 Bag-1 抗体（美国Santa Cruz 公司） ，兔抗人 Bcl-2 抗体和链霉亲合素-生物素- 过氧化物酶复合物（SABC）免疫试剂盒（北京中山生物制品公司） 。1.3实验方法采用常规 SABC 法（按试剂盒说明书方法）测定 Bag-1 和 Bcl-2 的表达， 抗 Bag-1 的工作浓度 1：50 ，生物素化单抗和 SABC 试剂的工作浓度均为 1：100 。石蜡组织连续切片 5 m ，载玻片防脱片处理，常规脱蜡至水。石蜡切片经热抗原修复，滴加正常山羊血清封闭，室温 20 min，滴加 1：50 抗 Bag-1 或Bcl-2 抗体，4 孵育过夜，次日滴加生物素化山羊抗兔IgG， 2037 20 min，再滴加 SABC 试剂，2037 20 min，PBS 清洗 5 min 4 次，3-3-二氨基联苯胺-4 盐酸盐（DAB）室温显色 20 min，苏木精复染，脱水，透明，封片。以PBS 代替一抗作阴性对照，以已知阳性反应片作阳性对照。41.4判定标准Bag-1 和 Bcl-2 皆以细胞质、细胞核棕黄色为阳性。随机观察 5 个视野，计算其平均数，每个视野计数 100 个细胞。Bag-1 阳性细胞占肿瘤细胞数30%为高表达（） ；Bcl-2 阳性细胞占肿瘤细胞数30%为低表达（） ，30%50%为中度表达（） ，50% 为高表达（） 。1.5统计学方法应用 SPSS 10.0 统计软件进行数据分析，阳性表达率比较用 2 检验， Bag-1 与 Bcl-2 的关系采用相关系数（r）分析。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1Bag-1 与 Bcl-2 在结肠癌组织表达2.1.1Bag-1 的表达 Bag-1 的免疫组织化学染色分为不表达、细胞质表达、细胞核表达和在二者同时表达 4 种形式。大部分表达在细胞核，小部分表达在细胞质，呈棕黄色颗粒，染色强弱不等。Bag-1 在正常组织中阳性表达率为 10%（ 2/20） ，结肠癌组织的阳性表达率为 64.1%（82/128） ，二者差异有统计学意义（0.05，图 1） 。52.1.2Bcl-2 的表达Bcl-2 蛋白的表达部位主要在细胞核或细胞质，呈灶性或弥漫性分布。正常组织中 Bcl-2 蛋白阳性表达率为10%（2/20） ，主要在细胞核呈灶性分布；结肠癌组织中 Bcl-2 蛋白表达阳性率为 70.3%（90/128） ，在细胞核或细胞浆内呈灶性或弥漫性分布（图 2） 。结肠癌组织中 Bcl-2 蛋白表达明显高于正常组织，二者差异具有统计学意义（0.05） 。2.1.3Bag-1 与 Bcl-2 的相互关系结肠癌标本中 Bag-1 和Bcl-2 均阳性表达 54 例，均阴性表达 14 例，对结肠癌标本中 Bag-1 与 Bcl-2 蛋白的平均阳性表达数进行分析， r=0.475，二者成正相关。2.2Bag-1 和 Bcl-2 表达与结肠癌病理类型的关系Bag-1 蛋白在腺癌中阳性率为 63.0%（58/92） ，在黏液癌中阳性率为70.0%（14/20） ，在未分化癌中阳性率为 62.5%（10/16） ，三者比较差异无统计学意义（0.05） ；Bcl-2 蛋白在腺癌中阳性率为71.1%（64/92） ，在黏液癌中阳性率为 80.0%（16/20） ，在未分化癌中阳性率为 62.5%（10/16） ，三者比较差异无统计学意义（0.05，表 1） 。2.3Bag-1 和 Bcl-2 的表达与结肠癌病理分级的关系在高分化、中分化和低分化腺癌中 Bag-1 蛋白阳性表达率分别为633.3%（12/36） 、77.8%（28/36）和 90.0%（18/20） ，三者之间比较差异有统计学意义（0.05，见表 1） 。2.4Bag-1 和 Bcl-2 的表达与结肠癌 Dukes 分期的关系本研究结肠癌 Dukes 分期为 A、 B、C 和 D 期标本中 Bag-1 蛋白阳性表达率分别为 27.2%（12/44） 、73.7%（ 28/38） 、85.7%（24/28）和 100%（18/18 ） ，各期间比较差异有统计学意义（P0.05 ，表2） 。2.5Bag-1 和 Bcl-2 的表达与预后的关系本研究患者均获随访，按 5 年生存率分组，术后存活超过 5 年 84 例，Bag-1 蛋白在两组标本中的表达差异具有统计学意义（P0.05，见表 2） 。3讨论 Bag-1 基因是 1995 年首先报道的一种抗凋亡基因，其分泌7蛋白是一种已经被确认的多功能结合蛋白，它不属于 Bcl-2 家族成员，但可与之相互结合、相互作用，增强其抗凋亡的能力1-4 。Bag-1 在正常组织中几乎不表达，而在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌及胃肠道恶性肿瘤中都有阳性表达5-6 ，Naishiro 等7报道 Bag-1 能够促进胃癌细胞的远处转移。有研究表明在结肠癌标本中 Bag-1 细胞核表达阳性的患者其伴有远处转移的概率要高于胞核表达阴性的患者，且 5 年生存率要明显低于其他患者 8-9 。本研究表明 Bag-1 在结肠癌组织中阳性表达明显高于正常组织，且 Bag-1 蛋白在结肠癌细胞的细胞质和细胞核均阳性表达，可能与本研究所用的多克隆 Bag-1 抗体可以同时作用于存在于细胞质的短蛋白分子 Bag-1S 和存在于细胞核的长蛋白分子 Bag-1L 有关8 。本研究还显示 Bag-1 的表达与结肠癌组织的细胞类型无关，与结肠癌的病理分级密切相关，病理分级越高，其阳性表达率也越高。Bag-1 的表达在肿瘤的直径、浆膜浸润程度、淋巴结转移等临床病理因素方面差异无统计学意义，与肿瘤的 Dukes 分期、是否有远处转移及 5 年生存率呈明显相关，肿瘤的临床分期越晚，Bag-1 表达阳性率越高，患者预后越差，说明 Bag-1 在肿瘤的发生发展分化过程中都起重要的作用，对 Bag-1 的深入研究可能对结肠癌的早期诊断及预后产生深远的影响。Bcl-2 是一种抗凋亡基因，通过抑制细胞凋亡而参与肿瘤的发生，在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等多种肿瘤研究中 Bcl-2 与肿瘤的分8级、分期及预后无关，但也有研究认为 Bcl-2 的表达与肿瘤的分级、分期及预后有关10-12 ，可能与应用不同的免疫组织化学方法、抗体及各地的实验室条件不同有关。本研究表明 Bcl-2 在影响结肠癌各种临床病理因素中阳性表达率都很高，提示 Bcl-2 的表达与结肠癌的各种临床病理因素没有明显相关性，Bcl-2 可能参与结肠癌的发生过程，但与肿瘤的发展分化无明显相关性。Bag-1 基因是一个正调节 Bcl-2 抗细胞凋亡的蛋白，Bag-1 基因并非 Bcl-2 家族成员的同源物，但其启动子区与 Bcl-2 具有高度同源性，两者可以形成复合物，并相互作用，从而增强细胞抗凋亡的能力，其作用机制可能与影响蛋白质的稳定性有关3，10，12 。本研究发现在结肠癌组织中 Bag-1 与 Bcl-2 的阳性表达成正相关，提示结肠癌的发生发展是由多基因调控的，其中 Bag-1 与 Bcl-2 基因在其发病过程中发挥重要作用，且具有相互增强的作用。探索Bag-1 与 Bcl-2 基因在结肠癌发生发展过程中的作用，对结肠癌的早期诊断和指导治疗有着重要的意义。