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1海人酸致痫大鼠脑组织超微结构的改变及促红细胞生成素的保护作用作者:吴绥生 谷金宁 李杰 张秀敏 王林全【摘要 】 目的 观察海人酸( kainie acid,KA)致痫大鼠脑组织超微结构的改变及促红细胞生成素(EPO)的保护作用。方法 采用雄性 Wistar 大鼠 9 只,随机分为 3 组:对照组(PBS 组) 、模型组(KA 组)和 EPO 组,在癫痫发作 6 h 后,应用电子显微镜观察心肌超微结构的变化。结果 PBS 组:细胞核呈椭圆形,核膜清楚,核内染色质分布均匀,可见一个大而明显的核仁位于细胞核中央,粗面内质网轻度扩张;细胞质内可见平行排列的内质网。KA 组:线粒体普遍肿胀、空化,线粒体嵴断裂,粗面内质网扩张、数量较少,细胞质内可见较多溶酶体,高尔基体轻度扩张,核固缩。EPO 组:细胞核呈椭圆形,核仁清楚可见,核内粗面内质网排列整齐,线粒体无空化表现,粗面内质网丰富。结论 KA 诱导的癫痫可以导致脑组织超微结构的损伤,应用 EPO 后脑组织的超微结构明显改善,减轻了由癫痫引起的脑细胞损伤,保护脑组织。 【关键词】 癫痫;促红细胞生成素;超微结构;脑组织本研究旨在观察海人酸(Kainic acid,KA)致痫大鼠脑组织超微2结构的改变及促红细胞生成素(EPO)的保护作用。1 材料与方法1.1 动物来源实验动物选取雄性 Wistar 大鼠 9 只,体重(25010)g,由吉林大学动物室提供(质量合格证:吉 20080005) ,全部动物在室温下饲养。1.2 仪器与试剂动物大脑立体定位仪(BUNKYOKV113TOKYO ,日本) ;超薄切片机(LKBIII ,瑞典) ;微量进样器(宁波) ;牙科钻(ARATHON,韩国 SAEYANG CO.公司) ;透射电子显微镜(EM1200EX ,日本) ;EPO(怡宝,上海克隆生物高技术有限公司) ;KA(美国 Sigma 公司) 。1.3 动物分组对照组磷酸盐缓冲液(PBS)组:右侧杏仁核(前囟后 2.0 mm,旁开 5.0 mm,颅骨表面以下 8.0 mm。 )注射 0.01 3mol/L PBS 1 l; 模型组(KA 组):KA 致痫组;EPO 组:提前 24 h 经尾静脉给予稀释的 EPO 500 l(500 U/ml)后,KA 致痫后持续 6 h。每组 3 只。1.4 模型制备与标本的留取Wistar 大鼠称重后,用 10%水合氯醛 0.30 g/kg 腹腔注射麻醉大鼠。上耳棒,将大鼠固定于立体定位仪上,并读出两外耳道的水平刻度,将立体定位仪水平线调零。用一个加热灯,使大鼠直肠温度保持在 37。在头颅正中做菱形切口,暴露颅骨及前囟和后囟,将立体定位仪正中线调零。用小型牙科钻按上述坐标钻透顶骨,当钻至硬脑膜处时,停止钻孔,用钩针挑破硬脑膜后,用 1 l进样器向右侧杏仁核注入 1 g/ml的 KA1 l,速度为 1 l/min,注药后留针约 5 min 后,缓慢退出进样器,以保证药物被完全吸收。注射完毕,取针后,外敷青霉素,缝合皮肤切口,将大鼠放在 50 cm30 cm50 cm 敞口有机玻璃罩中,使大鼠能够自由活动,并进行行为学观察。每组达到癫痫发作标准后,用 10%水合氯醛,按0.30 g/kg 腹腔注射麻醉大鼠。将大鼠固定于木板上,沿正中线剪开皮肤,沿肋骨下缘将腹部肌肉横切,用剪刀剪开,沿肋骨内缘将横膈切开,顿性剥离,沿胸骨柄左侧向上逐一剪断肋骨,用止血钳夹住胸骨柄及肋骨向外翻转,充分暴露心脏。将心脏固定后,再将输液针经左心室刺入到主动脉,剪开右心耳,打开输液器。用 37 40.9%生理盐水 50 ml 灌注动物,滴速为 3.3 ml/min,灌注 15 min。生理盐水灌注完毕后,立即改用 4 4%多聚甲醛和 4%戊二醛混合液作为灌流液 50 ml 灌注动物,灌注 20 min。灌注完毕后,取出心脏,放入培养皿中切取心尖部分放入 2.5%戊二醛的固定液中固定,放入 4冰箱中保存。经 2.5%戊二醛固定后,再用 1%锇酸后固定,乙醇系列脱水,Epon812 环氧树脂包埋, LKB 型超薄切片机半薄切片定位后做超薄切片;醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色,JEM1200EX 型透射电子显微镜观察、摄片。1.5 癫痫大鼠的分级按 Racine 分级法,将大鼠行为分为以下 6 级。0 级:正常行为状态。级:湿狗样颤动,面部痉挛抽动,包括眨眼、动须、节律性咀嚼等。级:级加节律性点头。级:级加前肢痉挛。级:站立并伴双侧前肢痉挛。级:持续站立、倾倒、失平衡、四肢抽动。级以上认为是充分点燃,完全点燃的标准是连续 3 次级或以上的运动性惊厥。2 结 果PBS 组细胞核呈椭圆形,核膜清楚,核内染色质分布均匀,可见一个大而明显的核仁位于细胞核中央(图 1A) ,粗面内质网轻度扩5张;细胞质内可见平行排列的内质网(图 1B)。KA 组:核固缩,线粒体肿胀、空化,线粒体嵴断裂,粗面内质网扩张、数量较少。细胞质内可见较多溶酶体,高尔基体轻度扩张(图 1C、1D) 。EPO 组:细胞核呈椭圆形,核仁清楚可见,核内粗面内质网排列整齐,线粒体无空化表现,粗面内质网丰富(图 1E)。3 讨 论癫痫发作时脑电冲动形成异常增加,可能与脑内的兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸比例失衡有关,目前对癫痫引起的脑细胞损伤的机制尚不清楚。KA 是谷氨酸受体激动剂,在结构上与 L 型谷氨酸相似,可与谷氨酸受体相结合并使其受体活化,从而导致脑内兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸的比例失衡,谷氨酸是一种潜在的神经细胞兴奋性毒素,过量将导致神经细胞的死亡1 。本研究显示 KA 组比PBS 组损伤明显。KA 通过模拟谷氨酸与其受体结合,引起脑内产生异常的神经冲动,通过相应的机制引起脑组织超微结构的变化,引起线粒体和内质网等结构的损伤,而线粒体的损伤可能是癫痫后神经元损伤的关键环节2 ,线粒体和内质网等结构受损后脑细胞的功能受损,进而引起脑组织的损伤。EPO 作为一种传统的治疗各种原因引起的贫血药物,对红细胞的生成起决定作用。近年来发现 EPO 对靶器官有抗炎、抗凋亡作用。EPO 主要通过与 EPO 受体结合后发挥保护作用,而线粒体是机体6能量的提供者,直接影响细胞或器官的功能,线粒体膜的稳定对线粒体的功能起决定性作用。研究表明,EPO 的抗凋亡机制与保持线粒体膜稳定有关3 ,应用 EPO 后心肌超微结构与 KA 组相比明显改善,说明应用 EPO 后,通过 EPO 与 EPO 受体(EPOR)结合使蛋白激酶 B(PKB)活化后阻止线粒体去极化,防止细胞色素C(CytC )外漏,使 CytC不能通过凋亡蛋白酶活化因子1(Apat1)而激活半胱氨酸蛋白酶( caspase)8 、9、3 ,从而阻断凋亡4 。CytC 是细胞呼吸链的一个重要组成部分,CytC 外漏减少,有利于心肌细胞线粒体呼吸链的稳定,为机体提供充足的能量,减少细胞的凋亡。在心肌细胞中 EPO 可以限制线粒体通透性转运孔的开放5 ,减少线粒体内容物的外漏以及降低线粒体通透性,防止线粒体细胞膜跨膜电位下降,促使线粒体结构的稳定和功能的恢复,提供能量供应,保护脑组织。研究显示:EPO 对损伤部位附近的神经元有间接的神经保护作用6 ,在脑中可以补充干细胞7 ;特别是在缺血性损伤后 8 ,在改善细胞超微结构的同时,可能促进神经细胞的发生,补充受损的神经细胞。所以,EPO 可以减轻癫痫引起的脑组织超微结构改变。本研究为探索癫痫引起的脑损伤提供了新的治疗途径。【参考文献】1 刘夫玲,牛膺筠,王红云. 促红细胞生成素的神经保护功能与视网膜保护作用J.中华眼底病杂志,2005;21(3):71969.2 孙建英,迟兆富 ,吴 伟,等.海人酸致痫大鼠海马 CA3 区神经元线粒体超微结构损伤的观察J.青岛大学医学院学报,2007;43(2):1323.3 张渝华,张 勤.促红细胞生成素的器官保护作用研究进展J.重庆医学,2005;34 (8 ):12446.4 Chong ZZ,Kang JQ,Maiese K.Hematopoietic factor erythropoietin fosters neuroprotection through novel signal transduction cascadesJ.J Cereb Blood Flow Metab,2002;22(5):50314.5 Juhaszova M,Zorov DB,Kim SH,et al.Glycogen synthase kinase3beta mediates convergence of protection signaling to inhibit the mitochondrial permeability transition poreJ.J Clin Invest,2004;113(11):153549.6 King VR,Averill SA,Hewazy D,et al.Erythropoietin and carbamylated erythropoietin are neuroprotective following spinal cord hemisection in the ratJ.Eur J 8Neurosci,2007;26(1):90100.7 Shingo T,Sorokan ST,Shimazaki T,et al.Erythropoietin regulates the in vitro and in vivo production of neuronal progenitors by mammalian forebrain neural stem cellsJ.J Neurosci,2001;21(24 ):973343.8 Tsai PT,Ohab JJ,Kertesz N,et al.A critical role of erythropoietin receptor in neurogenesis and poststroke recoveryJ.J Neurosci,2006;26(4) :126974.
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