1rhTNF 对 TBLCL 趋化作用的研究作者：闵密克，马超武，徐建中，孙浩，金伯泉 【摘要 】 目的 研究重组人 TNF（recombinant human tumor necrosis factor，rhTNF ）对扁桃体 B 原淋巴细胞（tonsil B lymphoblastoid cell line，TBLCL ）的趋化作用，建立一个模型以研究细胞因子与 B 细胞相互间的作用。方法 用 EB 病毒（EpsteinBar virus，EBV）转化扁桃体 B 细胞建立 TBLCL系，以小室法研究 rhTNF）对 TBLCL的趋化作用。结果 rhTNF对 TBLCL有明显趋化作用，并呈剂量依赖关系。这种作用能为抗TNF的单抗 E6 所阻断。结论 以上为研究细胞与细胞因子间的相互作用提供了有用而简便的模型。 【关键词】 重组人 TNF； 扁桃体 B 原淋巴细胞；趋化Abstract： Objective To investigated the chemoattractant of rhTNF on TBLCL.Methods LTC were transfected with EBV to get tonsil B lymphoblastic cell line(TBLCL).Results It was found rhTNF can chemoattracts TBLCL,in a osedependnt manner and this chemiotactic 2effect can be blocked by the neurtralizing antobody E6 against TNF.Conclusion This is a useful model in study the interfere between chemokine and immunocyte.Key words： recombinant human tumornecrosis factor;tonsil B lymphoblastoid cell line;chemoattractantCorcione 等1 发现 TNF对人扁桃体初始 B 细胞以及记忆 B细胞有趋化作用，还发现所有扁桃体 B 细胞均可以合成 TNF。因此他们认为 TNF以旁分泌与自分泌的形式参与调节 B 淋巴细胞在次级淋巴器官中的迁移。为了进一步的研究，需建立一个合适的模型。1 材料和方法11 材料可产生国际标准 EBV 毒株的 B958细胞由第四军医大学免疫教研室保存。rhTNF 由第四军医大学生物技术中心惠赠。二甲基亚砜（DMSO）购自 FLUKA 公司。鼠抗人 HLADR，CD 19 mAb 由第四军医大学免疫教研室制备。趋化小室底膜孔径为 8 m，由日本仓敷纺绩株式会社出品。夹心法 ELISA 检测 TNF试3剂盒由第四军医大学免疫教研室出品。12 方 法121 EBV 的制备复苏 B958细胞。用含 20%FCS 的 RPMI1640完全培养基（Sigma 公司） ，在 37 ，5%CO2 的孵箱中培养 15 d。离心，2 500 r/min，1 min，上清以 045 m 滤器过滤后冻存备用。122 腭扁桃体细胞（ palatine tonsil cell，PTC）的准备PTC 单细胞悬液以前述方法制备，记数。离心，1 000 r/min，3 min，弃上清。沉淀重悬于冻存液含 10% DMSO 的FCS（V/V） 中，1106/ml。置于-70 冰箱，24 h 后移入液氮中。123 TBLCL的制备复苏冻存的 PTC，调整细胞数至 5105/ml。取 1 ml 加入10 ml 离心管中，再加入等体积 B958（EBV 高产株）培养上清液，4置于 37 ，5% CO2 的孵箱培养。每周加含 20%FCS 的RPMI1640 05 ml。3 周后，移至 25 ml 培养瓶中继续培养。4周后，可见增殖迅速、形态似母细胞样并相互聚合成团的TBLCL，即可扩大培养。124 间接免疫荧光染色和流式细胞术分析鉴定 TBLCL用直头滴管， 轻轻吹打 TBLCL悬液， 直至其成为单细胞悬液，调整细胞浓度至 5106/ml，各取 40 l 细胞悬液，分别加入有 HLADR，CD19，CD3 和 SEB 单抗的离心管中，再加入1：20 灭活的正常山羊血清。4 ，静置 30 min，洗涤液洗涤 2 次，1 000 r/min，5 min。弃上清，加入 50 l 1:100 稀释的，FITC 标记的兔抗鼠 IgG F（ab ）2 段，摇匀，4 静置 30 min。洗涤两次后加入 200 l 固定液，流式细胞仪检测 TBLCL上各类分子的表达情况。125 rhTNF对 LCL 的趋化作用将不同浓度的 rhTNF（比活性 106 U/mg）分别加入 24孔板，400 l/孔。调整 TBLCL至 1106/ml，取 200 l 加入趋化小室。将小室置于 24 孔板中，37 ，5% CO2 孵育。实验终止时在 24 孔板中加入 EDTA，终浓度为 5 mmol，继续孵育 15 5min。人工记数 24 孔板中的 TBLCL浓度。126 夹心 ELISA 法检测小室内外 rhTNF浓度的变化留取不同时间点小室内和 24 孔板中溶液样品，用夹心法ELISA 检测 TNF试剂盒检测 rhTNF浓度的变化。将包被抗体用包被缓冲液 1：100 稀释后，加入 ELISA 板，100 l/孔，4 过夜。洗涤液冲洗 ELISA 板 3 次，加待测样品、阴性对照及倍比稀释的标准品，100 l /孔，37 ，1 h。洗板 3 次，加 1：100 稀释的酶标抗体，100 l/孔，37 ，1 h。洗板 3 次，加入显色液100 l/孔， 37 ，显色 15 min。ELISA 读数仪测 410 nm 处 OD值，绘制标准曲线，计算 rhTNF的浓度。127 抗 TNF的单抗 E6 对 TNF对 TBLCL趋化的抑制作用在 24 孔板中加入 10 g/L rhTNF。分别加入不同浓度的具有中和活性的抗 TNF的单抗 E6，自 1 g/L 到 1 000 g/L， 37 ，预先孵育 15 min。其余步骤同前。分别计数TBLCL自发游走的数，最大趋化数，及加了抗体后的趋化数，计算逆转率 V（最大趋化数- 加了抗体后的趋化数）/ （最大趋化数-自发游走的数） 。第 1 期 rhTNF对 TBLCL趋化作用的研究 闵6密克，等2 结 果21 TBLCL的转化成功和表型鉴定与 EBV 共同培养 2 周后即可见有少量形态多样，聚集成团的细胞出现。由于此时系统中仍有 CTL，转化的细胞增长缓慢。到第四周时，CTL 全部死亡后，LCL 的数量迅速增加。流式细胞术（flow cytometry，FCM）鉴定表明 TBLCL为 CD19+，CD3-，且 HLAD类分子表达增加，如图 1。22 rhTNF趋化 TBLCL的浓度依赖性TBLCL对 rhTNF的趋化反应呈浓度依赖。在 10 g/L 达到最大，如图 2。在不含 rhTNF的阴性对照孔，仍有 TBLCL渗出于小室外。为了证实这部分细胞不是自小室底膜“漏”出的，我们预先将 TBLCL用 4%多聚甲醛固定后再进行趋化实验。发现阴性对照中不再有渗出的细胞。可见这是一种细胞无定向的、自发的、无规则运动。23 rhTNF趋化 TBLCL的动态变化7根据细胞种类的不同，采用的趋化作用时间长短不等，最短为 1h，最长可至 5 h。本研究以 5 h 末自小室趋化出的细胞数为100%，计算不同时间点趋化出的细胞的百分率。2 h 即有577%，3 h 已达到 923%（图 3） 。24 小室内外 rhTNF浓度变化趋势 趋化开始时小室内液面高于小室外，大约 40 min 后，两液面持平（图 4） 。此时小室外的 rhTNF开始向小室内扩散。随着时间的推移，小室内 rhTNF的浓度逐渐增加，小室外浓度缓慢下降。到第 5 h 末，小室内外仍存在浓度差。25 抗 TNF的单抗 E6 对趋化的阻断为了证实 TBLCL的趋化现象是由 rhTNF引起的，我们将不同浓度 E6 与 10 g/L TNF预先孵育，然后再进行趋化实验，同时以无关抗体 SEB 设立相应的对照组。在抗体浓度为 1 000 g/L时，E6 对 10 g/L TNF趋化的逆转率可达 538% （图 5） 。3 讨论EBV 通过与 B 细胞表面的受体 CD21 结合而感染 B 细胞，8使其母细胞转化成为 LCL。LCL 虽然形态上呈现多样性（梭形、椭圆形、梨形等等） ，而且已经永生化，可以无限分裂增殖，并表达许多 B 细胞活化抗原和黏附分子，但是其 B 细胞的基本性质及遗传特征并未改变，因此可以用此法保存某些具有特定生物学性状的标本。基于以上原因，EBV 转化 B 细胞是一种常用的，简便有效的建立细胞系的方法。目前建立 LCL 一般采用环孢素 A（CysA ）法，此方法操作复杂，成功率在 40%60%之间。原因是 B 细胞被 EBV 转化后会遭到 CTL 的攻击。一方面转化后的 B 细胞不断增殖，另一方面培养中的 CTL 分化为效应 CTL，并不断杀灭 LCL。双方斗争一直持续3 周左右。当培养中的 CTL 全部死亡时，LCL 迅速增殖，即转化成功。CysA 通过抑制 CTL，可提高转化率。曾有研究表明，用 EBV转化扁桃体细胞难度较大，因为扁桃体中 EBV 特异性 CTL 的细胞毒活性高2，本研究将冻存细胞法3和微量细胞法相结合制备 LCL，取得了满意的转化率(11/11)。可能因为采用这一方法后，转化系统中细胞总数少，CTL 的数量相应减少，同时冻存 复苏的过程影响了 CTL 的活性抑或使 B 细胞对 EBV 的敏感性增加，故而转化率提高。本研究以 EBV 转化的扁桃体 B 原淋巴细胞（TBLCL ）作为研究对象。与组织细胞或其他已建系的细胞相比 LCL 有很多独特之处，例如表达许多黏附分子，容易聚集成团，这影响了最终实验结果的评定。本实验根据这个特点，相应在方法学上进行了一些改动。常规趋化实验结果评价的方法是在实验结束时将小室底部的膜揭下，经固定、染色后显微镜下随机记数 5 个高倍视野中的细胞数 4。由9于 TBLCL通过小室膜后，大多数自膜上脱落，只有极少量仍黏附于膜上。并且 TBLCL有黏附成团的倾向，不能均匀地分布于膜上，因此随机选取视野难以代表整体情况。本研究将评价结果的方法稍作改动。在实验结束时加入 EDTA，终浓度为 5 mmol，孵育 15 min，使得黏附于小室膜底面上的细胞脱落下来，然后通过仔细记数 24 孔板中 TBLCL浓度反映 TNF趋化 TBLCL的程度。本实验证明了 rhTNF对 TBLCL有趋化作用。首先 rhTNF对TBLCL的趋化作用是浓度依赖的。在 rhTNF浓度为 10100 g/L 时，趋化出小室的细胞最多。其次趋化呈规律的动态变化，游走出的细胞在 03 h 增加最迅速，3 h 以后，趋化运动接近停滞。存在趋化剂的浓度梯度是趋化的必要条件。通过 ELISA 检测可知，在整个趋化过程中，小室内外始终存在浓度梯度。最后，rhTNF对 TBLCL的这种趋化作用可被具有中和活性的抗 TNF的单抗E6 阻断，而无关抗体 SEB 则没有阻断作用，证明这种趋化作用是由rhTNF引