1心肌 肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体的构建及鉴定关键词】 心作者：潘国栋 黄永章， 郭凌郧， 唐俊明， 孔 霞， YANG Qinglin， 王家宁 肌特异性；肌球蛋白重链；启动子；增强型绿色荧光蛋白；干细胞 摘 要 目的： 构建并鉴定心肌 肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体（MHC-EGFP ） ，该基因只在心肌中特异性表达。 方法： 设计 5和 3分别具有 SalI/Hind酶切位点的EGFP 引物，聚合酶链反应法（PCR）从 pLEGFP 质粒中扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的 cDNA，插入 pGEM-T Easy 载体表达盒，构建 pGEM-EGFP，SalI/Hind双酶切后回收 729 kb 片断，插入经相同酶切的含 5.5 kb 心肌特异性 肌球蛋白重链启动子的pNC26 质粒，构建 pMHC-EGFP。连接产物转化感受态 DH5，挑选克隆，PCR 扩增鉴定，重组质粒经 NotI 酶切，回收 7.2 kb MHC-EGFP 表达盒。分离培养小鼠心肌细胞与骨骼肌成肌细胞。MHC-EGFP 表达盒通过脂质体法分别转染心肌与骨骼肌成肌细胞。荧光显微镜观察转染细胞是否出现绿色荧光，以鉴定 MHC-EGFP表达盒是否具有表达特异性。结果： EGFP cDNA 正确插入2pNC26 质粒中 MHC启动子 3端。成功转染 MHC-EGFP 表达盒的心肌细胞出现绿色荧光，而转染的骨骼肌成肌细胞无荧光出现。结论： MHC-EGFP 表达盒具有心肌特异性表达特性，为进一步监测干细胞向心肌分化研究奠定基础。关键词 心肌特异性；肌球蛋白重链；启动子；增强型绿色荧光蛋白；干细胞Abstract: Objective To construct and identify the cardiac -myosin heavy chain promoter (MHC) -driven enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression vector (pMHC-EGFP), which solely expresses EGFP in cardiomyocytes. Methods EGFP cDNA primers were synthesized with forward primer and reverse primer containing SalI and Hind, respectively. EGFP cDNA was amplified by polymerase chain reaction (PCR), added single deoxyadenosine at 3 ends, and subcloned into pGEM-T easy vector to construct pGEM-EGFP. The fragment of 729 bp from SalI/Hind-digested pGEM-EGFP was subcloned into pNC26, a plasmid carried 5.5 kb MHC promoter, to construct pMHC-EGFP. The expression cassette of 7.2 kb MHC-EGFP was recovered with low melting point agarose electrophoresis. Mouse cardiomyocytes and skeletal 3muscle myoblasts were isolated and cultured in vitro. MHC-EGFP expression cassette was transfected into cardiomyocytes and myoblasts, respectively. EGFP expression was observed under fluorescent microscope. Results EGFP cDNA was successfully inserted into the 3 ends of MHC promoter. The green fluorescence could be observed in transfected cardiomyocytes, but not in transfected myoblasts. Conclusion MHC-EGFP expression cassette can be specifically expressed within cardiomyocytes, which provides a basis to monitor the differentiation of stem cells into cardiomyocytes.Key words:Cardiac-specific; Myosin heavy chain; Promoter; Enhanced green fluorescent protein; Stem cells近年来日益兴起的大量干细胞研究证实，胚胎或成体间充质干细胞在一定条件下可以分化为心肌样细胞，为心脏疾病的治疗带来了希望。然而这些心肌样分化的干细胞是否具有成年心肌的收缩和传导功能，目前研究还相当缺乏。这是因为通过免疫组织化学或细胞化学染色判断干细胞分化，需要先对细胞进行固定处理，不能在活细胞状态下观察干细胞的心肌分化。本研究将心肌特异性 肌球蛋白重链（alpha-myosin heavy chain, MHC）启动子与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）连接，4构建在心肌中特异表达的报告基因系统，使之用于在活细胞状态下观测判断干细胞的心肌分化，为深入进行干细胞的心肌分化研究奠定基础。1 材料与方法1.1 材料限制性内切酶 SalI、Hind、 NotI 以及 200 bp DNA ladder 和 Lambda DNA/Hind markers 购自华美生物工程公司；Taq 聚合酶、T4 DNA 连接酶、dNTP 和 dATP 购自 Promega 公司；pfu DNA 聚合酶购自 New England Biolabs 公司；Lipofectamine 2000 阳离子脂质体购自 Invitrogen 公司，DMEM培养基购自 Gibco 公司；新生牛血清购自四季青生物材料有限公司；包含 5.5 kb MHC 启动子的 pNC26 质粒由 Morehouse School of Medicine 提供；包含 EGFP cDNA 的 pLEGFP-C1 质粒购自Clontech 公司；pGEM-T Easy Vector 系统购自 Promega 公司；5端加有 SalI 和 Hind酶切位点的 EGFP cDNA PCR 上下游引物（上游：5-GTC GAC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC -3，下游：5-AAG CTT TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG -3）由北京赛百盛基因技术有限公司合成。1.2 方法51.2.1 pMHC-EGFP 构建策略（图 1）1.2.2 EGFP cDNA 扩增：以 pLEGFP-C1 为模版，20 mmol/L的上下游引物各 5 l，pfu DNA 聚合酶 1 l，10buffer 5 l，10dNTP 5 l，加双蒸水至总反应体积 50 l。进行聚合酶链（polymerase chain reaction, PCR）反应：起始变性 94 5 min，然后执行 94 30 s，60 30 s， 72 90 s，30 次循环，最后 72 延伸 10 min。低熔点琼脂糖凝胶电泳回收 729 bp EGFP cDNA 片断。1.2.3 “T”连接反应：参照本所已建立的方法1-2，将回收纯化的 729 bp PCR 产物，加入 10buffer 5 l，10MgCl2 5 l，2 mmol/L dATP 2 l，Taq 酶 2 l，加双蒸水至总反应体积50 l，72 孵育 30 min。回收纯化加“A”后的 EGFP cDNA 片断（731 bp） ，加 10T4 DNA 连接 buffer 5 l，pGEM-T Easy vector 0.5 l，T4 DNA 连接酶 1 l，加双蒸水至总反应体积 10 l，室温连接 3 h。将连接产物转化 DH5，涂布含氨苄青霉素（100 g/ml）的 LB 琼脂培养基上培养 12 h，蓝白筛选，挑选白色单菌落接种于含氨苄青霉素（100 g/ml）的 TB 培养基中培养12 h，提取质粒酶切鉴定。重组质粒命名为 pGEM-EGFP。1.2.4 MHC-EGFP 构建：将 pGEM-EGFP 和 pNC26 分别用SalI/Hind双酶切，前者回收 729 bp 片断，后者回收线性化6pNC26 片断。两种片断充分混匀，在 T4 DNA 连接 buffer 5 l，T4 DNA 连接酶 1 l，总体积 10 l体系中室温连接 4 h。连接产物转化 DH5，涂布含氨苄青霉素（100 g/ml）的 LB 琼脂培养基上培养 12 h，挑选单菌落接种于含氨苄青霉素（100 g/ml）的TB 培养基中培养 12 h，提取质粒酶切鉴定。重组质粒命名为pMHC-EGFP，经 NotI 酶切，低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收 7.2 kb 的 MHC-EGFP 表达盒。1.2.5 心肌细胞分离培养：取 1 d 龄新生昆明小鼠 10 只，无菌条件下取出心脏，PBS 漂洗，剪碎，加入 0.125%胰酶+0.02% EDTA 消化液，37 水浴消化 10 min，静置后弃上清。继续消化组织团块，每次加入消化液 34 ml，37 水浴消化 10 min，静置后收集上清，2 倍体积含 15%新生牛血清 DMEM 中止消化，重复 34 次。直至组织团块基本消失。将收集的消化液 2 000 rpm离心，弃上清，含 15%新生牛血清 DMEM 重新悬浮细胞，以1107/ml 接种于 25 cm 一次性塑料培养瓶，于 37 ，5% CO2，饱和湿度条件下培养 2 h，使大多数心肌成纤维细胞贴壁。转移尚未贴壁的心肌细胞至另一培养瓶中继续培养。1.2.6 骨骼肌成肌细胞培养：参考姚启盛等3 方法，取成年昆明小鼠，无菌条件下分离双下肢肌肉，PBS 漂洗，剪碎，加入dispase 2.4 u/ml,collagenase 1%,CaCl22.5 mmol/l 消化液 37 7水浴消化 30 min，2 倍体积含 15%新生牛血清 DMEM 中止消化，以 1107/ml 接种于 25 cm 一次性塑料培养瓶，于 37 ，5% CO2，饱和湿度条件下培养。1.2.7 MHC-EGFP 表达盒转染：上述心肌或骨骼肌成肌细胞接种2 d 后，进行 MHC-EGFP 基因转染。将纯化的 5 g MHC-EGFP与等体积 Lipofectamine 2000 阳离子脂质体 50 l充分混匀，静置 10 min 后，细胞培养液中加入脂质体 DNA 混合液，孵育 6 h 后换为普通完全培养液继续培养，荧光显微镜（Nikon TE2000, Japan）观察细胞是否出现绿色荧光。2 结果2.1 EGFP cDNA 扩增以 pLEGFP-C1 为模板，经 EGFP 上下游引物 PCR 扩增后，2%琼脂糖凝胶电泳可见特异性 729 bp 扩增片断（图 2 略） 。2.2 “T