泸州医学院本科学生设计性实验报告专业 临床 年级 11 班级 12 组长姓名 曹钰 小组成员 邹灿灿、唐林红、马红敏、徐丹、金鑫 张毕海、宋惠玲、曹钰 、滕章佩 课程名称 医学遗传学 时 间 2013.6.9 实验设计方案：实验名称 21 三体综合征产前诊断 指导教师余红总体设计思路在遗传学上先天愚型几乎全是新发生的，与父母的核型无关，而是由于配子形成过程中 21 号染色体不分离所致，统计资料表明，不分离绝大多数发生在患者母亲，并且母亲年龄越大（35 岁以上） ，染色体不分离的几率越高，出生 21 三体患儿的可能性越大。由于张某已经 31 岁，而且其一表姐曾生育一智力低下的 21 三题综合征儿子。 所以张某到医院做唐氏筛查，结果血清中 AFP、hCG、uE3 检测结果为阳性。其中 AFP 阳性尤为重要，因为 AFP 阳性与胎儿畸形有很大关联，例如：胎儿神经管畸形，畸形时羊水内 AFP 含量明显升高，可达 10 倍；胎儿其他畸形如先天性肾痛、先天性食道闭锁、脑疝、脑积水、囊性水肿、骶尾畸形瘤、糖尿病孕妇胎盘功能不足等，羊水 AFP 值均会升高。故 AFP 阳性且结合以上叙述，张某所孕胎儿为 21 三体综合征的风险很高，故建议张某做产前诊断。根据诊断结果提出中肯的建议，为张某做生育指导。具体设计方案：1实验目的1.掌握遗传病的产前诊断过程；2.通过对 21 三体综合征的诊断设计，培养运用遗传学现代技术解决 医学实际问题的能力。2实验原理方案一：羊膜穿刺法：羊水中有一定数量胎儿脱落细胞（多为成纤维细胞和上皮细胞）,经体外培养后,可进行染色体分析.酶和蛋白质检测性、染色体检查和提取 DNA 作基因分析，也可不经培养，用微量技术作酶和蛋白质分析或直接提取 DNA 作基因诊断。方案二：孕妇外周血中胎儿细胞检测：胎儿有 4 类细胞会经过胎盘进入母体循环中。这 4 类细胞为滋养层细胞、有核红细胞、淋巴细胞和粒细胞。在 1ml 母血中大约每 100 万个有核细胞中存在 1 个胎儿细胞，其波动范围相当大。面对如此稀少的胎儿细胞,首要的是使用某种有效的方法从母体中分离富集这些细胞。其中最合适做产前诊断的胎儿细胞类型当首推胎儿有核红细胞：胎儿有核红细胞因具有独特的形态学特征，含有全部遗传信息，生命周期短及存在特异性抗原而成为无创性产前诊断的主要研究对象。胎儿有核红细胞在早孕时就在母体血中出现，随着妊娠的进展而有所变化。在不同阶段，在母体血中所能检出胎儿有核红细胞的量亦不同。孕 17、18 周左右为产前诊断的最佳时间。3实验材料、试剂及器材3.1 材料离心管，离心机，天平，37温箱，载玻片，盖玻片，恒温水浴锅，光学显微镜，标本板，玻璃铅笔，定时钟，染色缸，滴管。3.2 试剂pH6.8 PBS 缓冲液，Giemsa，0.025%胰蛋白酶（取 0.9%氯化钠100ml，加 0.25%胰蛋白酶 1ml） 。3.3 主要仪器离心管，离心机，天平，37温箱，载玻片，盖玻片，恒温水浴锅，光学显微镜，标本板，玻璃铅笔，定时钟，染色缸，直柄虹膜镊，滴管。4实验方法及注意事项4.1 方法步骤方案一：1、对孕期合适孕妇，采用 B 超探查确定腹部穿刺点(羊水多且无胎儿肢体处)，或在 B 超监测下实施穿刺；2、穿刺羊水前，可让孕妇卧床连续翻转五次体位，使子宫内羊水中的胎儿细胞悬浮起来，方便穿刺抽取更多的胎儿细胞；3、使用穿刺包按无菌要求消毒穿刺点，铺洞巾，用穿刺针头穿刺，缓缓抽取 10-20 毫升羊水，沿管壁缓缓注入无菌离心管，用无菌封口封好；4、常规离心，无菌条件下打开封口，弃上清液，留 1 毫升左右羊水混匀细胞沉淀物成细胞悬液用于基因测试或细胞培养；5、将上述用于基因测试的细胞悬液 1 毫升装到准备好的 1.5 毫升无菌封口塑料离心瓶内;密封后连同孕妇的详细检测记录资料一起加上冰袋封好送往测试单位(或用特快专递邮寄)，测试单位收到后会留档并做基因测试(收费项目)；6、用于细胞培养则将悬液均匀分配到准备好的培养瓶内，无菌封口后置二氧化碳培养箱培养；每隔几天用倒置显微镜观察生长情况，根据需要更换部分培养基；培养 15-20 天，当细胞铺满瓶壁时，可收获细胞进行染色体分析；7、用显带技术进行染色体核型分析：（1）将制好的染色体标本，置 7275烤箱中烤片 3h。 （2）放入预温至 37的 0.025%胰酶溶液中（pH=7.27.4）消化 1min 左右，每次的作用时间并不完全相同，可先试一张片子，再根据显带效果调整胰酶作用时间。 （3）在 Giemsa 染液中染色 10min，自来水冲洗干净，晾干后，即可阅片。（4）镜检：在显微镜高倍目镜下检查显带标本，在染色体上若出现清晰的深浅相间的带型，即为可取标本，可供摄像分析。方案二：孕妇血有核红细胞（NRBC）含量极少，大约每 1ml 母血中只含520 个胎儿细胞，NRBC 更少，为每 1ml 含 26 个。胎儿细胞，必须进行分离纯化才能利于进一步分析，做产前诊断。目前，分离胎儿细胞有多种手段，主要包括密度梯度离心、磁激活细胞分类（MACS） 、荧光激活细胞分类（FACS） 、选择性细胞培养技术、尼龙毛柱分离法、单独溶解红细胞法等。其中密度梯度离心法是根据母血细胞与胎儿细胞的体积和内部结构等存在较大差异而推测出它们的密度也可能存在较大差异而设计的。密度梯度离心法分离出来的细胞丢失少、形态完整，但是富集的胎儿细胞纯度与产量均不够。还有改进技术如采用多重密度梯度离心以提高纯度。荧光激活细胞分类（FACS）法也是较常用的，分选 CD71+ 细胞，富集的胎儿细胞纯度与产量均较高，但操作步骤复杂可能导致细胞丢失;CD71 并非专一与 NRBC 结合，CD71+细胞不一定是 NRBC;而且所选NRBC 形态略有改变，细胞膜欠完整，也会给产前诊断技术带来困难。磁激活细胞分类（MACS）也是可行的。该技术的特点是在较短时间里获得较多的靶细胞，且分离后的细胞仍有活性，可供培养和流式细胞分析等。分离了胎儿细胞之后就和羊水穿刺一样做细胞核型分析。4.2 注意事项方案一：1.术前一天请沐浴;术前 10 分钟请排尽小便。2.若术前 37 天有感冒、发热、皮肤感染等异常，请在术前登记时告知医生。3.如有过敏史，特殊疾病史和其他需要说明的情况，请在术前登记时告知医生。4.术后至少静坐休息 2 小时后，方可乘车回家；外地病人当晚最好在本市住宿。5.术后 72 小时内不沐浴，多注意休息，尽量休息一周，前三天尽量卧床休息，后四天最好在家休息，避免大量的运动，逛街，做家务以及搬运重物等体力劳动。6.术后三天里如有腹痛、腹胀、阴道流水、流血、发热等症状,这些都是怀孕处于危险情况的迹象，请速到医院妇产科就诊。7.胰蛋白酶浓度和处理时间随气温高低有所不同。一般规律是标本存放时间越长，在胰蛋白酶当中处理时间越长。太新鲜的标本，染色体会出现毛茸现象。片龄很长的标本往往会导致斑点状的染色体。8.胰蛋白酶温度：温度越高，反应的速度就越快，一般是室温，但温度必须稳定至少 20min。9.胰蛋白酶处理的时间：如果细胞呈紫蓝色，说明胰蛋白酶的作用时间不够，如果细胞呈桃红色，说明作用时间刚好。5实验预期结果及遗传指导培养出的细胞进行核型分析：(1)标准型：占患者总数的92.5%，患儿体细胞染色体有 47 条，有一条额外的 21 号染色体，核型为 47，XX（或 XY）+21。(2)易位型:约占全部病例的 2.5%5%，多为罗伯逊易位，即着丝粒融合，其额外的 21 号染色体长臂易位到另一近端着丝粒染色体上。最常见为 D/G 易位，D 组中以 14 号染色体为主，核型为 46，XX（或 XY）-14，+ t（14q;21q） ，少数为 15号染色体。另一种为 G/G 易位，是由于 G 组中两个 21 号染色体发生着丝粒融合，形成等臂染色体，核型为 46，XX（或 XY）-21，+ t（21q；21q） 。 （3)嵌合型：仅占 21-三体综合征的 2.5%-5%，是指受精卵在有丝分裂期间染色体不分离而导致的，因此只是部分而不是所有的细胞存在缺陷。患儿体内含有正常和 21-三体细胞二种细胞株，形成嵌合体，核型为 46，XX（或 XY）/47，XX（或 XY）+21，其临床表现随正常细胞所占百分比而定。嵌合型的患儿的智商较其它两型高，临床并发症的发生率也相对较少。6参考文献： 医学遗传学产前遗传病诊断妇产科遗传学表观遗传学教师评分及意见评分：对实验设计方案的意见：签 名：年 月 日