利用黑曲霉发酵生产柠檬酸摘要：柠檬酸是目前以微生物发酵生产的重要有机酸之一，它的用途非常广泛，需求日益增长。目前国内柠檬酸年产量约 2.5105吨，其中半数以上供出口之用。80 年代，我国国内的柠檬酸消费急剧上升，速度远远超过了西方发达国家。随着人民生活水平的提高，对食品和饮料等含柠檬酸制品的需求量猛增，但就人均消费量来看，我国的柠檬酸消费还是很低的，以用于食品和饮料的柠檬酸为例，我国的人均消费量远低于美国和日本，市场潜力巨大，因此增加柠檬酸生产不仅可以满足国内日益增长的需要，也是换取外汇的重要手段之一。柠檬酸是葡萄糖经柠檬酸循环而形成的最有代表性的代谢产物，早已发展成大规模的商用生产。常用的菌种是黑曲霉，产酸浓度在每升发酵液中150g。关键词：黑曲霉，柠檬酸，三羧酸循环 1、柠檬酸用途柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。2、黑曲霉黑曲霉，子囊菌亚门，丝孢目，丛梗孢科中的一个常见种。广泛分布于世界各地。食品工业上用作发酵菌种，如用于食醋生产制曲、麸曲法白酒生产制曲、柠檬酸发酵等，主要是利用此黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能；在生物肥料工业上，黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物，便于作物吸收利用，改善土壤结构，增强土壤肥力，提高作物产量的效果。3、柠檬酸循环（citric acid cycle，CAC）又称三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA） ，Krebs 循环，由诺贝尔获奖者（1953 年） 、德国学者 H.A.Krebs 于 1937 年提出。是指由丙酮酸经过一系列环节作循环式反应而被彻底氧化、脱羧，形成 CO2、H 2O 和 NADH2的过程。这是一个广泛存在于各种生物体中的重要生物化学反应，在各种好氧微生物中普遍存在。在真核微生物中，柠檬酸循环的反应在线粒体内进行，其中的大多数酶定位于线粒体的基质中；在原核生物中，大多数酶位于细胞质内。只有琥珀酸脱氢酶属于例外，它在线粒体或原核细胞中都是结合在膜上的。3.1 TCA 循环的调节作用 3.1.1 TCA 循环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉 TCA 循环的第一个特点。顺乌头酸酶失活，阻断 TCA 循环是柠檬酸积累的必要条件。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在 pH2.0时失活，线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 的平衡，这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累而使 pH 值降低。 3.1.2 黑曲霉菌体内 -酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（TCA 循环被阻断） 。 3.1.3 氧和 pH 值对柠檬酸发酵的影响很大。标准呼吸链产生 ATP 积累，侧呼吸链不产生 ATP，缺氧导致侧呼吸链失活，使 ATP 积累，柠檬酸积累减少。4.发酵机理4.1 以薯干粉、玉米粉或淀粉等糖类为原料经黑曲霉柠檬酸产生菌糖化后产生高浓度的葡萄糖。4.2 黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸：葡萄糖以糖酵解途径、磷酸戊糖循环两种途径产生丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧形成乙酰 CoA，另一方面经 CO2 固定化反应后生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰 CoA 缩合产生柠檬酸。4.3 生理调节：柠檬酸是黑曲霉的良好碳源，故柠檬酸的积累是菌体代谢失调的结果。4.3.1Mn2+缺乏抑制蛋白合成NH4解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP 途径畅通，有一条呼吸活动强的不产生 ATP 的侧呼吸链4.3.2 由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰 CoA 和 CO2 的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。4.3.3 由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 同时控制 Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。4.3.4 随着柠檬酸积累，pH 降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。 5.黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响因素一般认为，黑曲霉适合在 2830时产酸。温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。微生物生成柠檬酸要求低 pH，最适 pH 为 24，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量。随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到 60饱和度对产酸有利。柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下降。参考文献 1 王镜岩，朱圣庚，徐长法，生物化学.高等教育出版社，2012,92-1122 周德庆，微生物学教程.高等教育出版社，2013,106-1483 胡雅琴，培养基组成对纤维素糖化液发酵生产柠檬酸的影响，山西化工，2003，第 23 卷第 4 期，20-21.