1胃癌患者外周血 Th1Th2 细胞因子的漂移及临床意义作者：吴平 陈捷 何惠娟 杨展【关键词】 流式细胞术【摘要 】 目的 检测胃癌患者外周血 CD3 + T 细胞分泌细胞因子的水平变化，分析 Th1 和 Th2 细胞的细胞因子免疫活动，为肿瘤的免疫治疗提供实验依据。方法 首先用刺激物刺激细胞，增加细胞内细胞因子的表达。然后加入荧光标记的特异性抗细胞因子单克隆抗体，特异性抗原抗体结合，最后应用流式细胞仪分析特异性细胞因子表达水平。同时用酶联免疫吸附法（ELISA）检测相应的细胞因子。结果 胃癌患者 Th1 型细胞因子干扰素-（IFN- ） 、白细胞介素-2（IL-2） 、白细胞介素-12（IL-12）表达水平较正常对照组显著降低，Th2 型细胞因子白细胞介素-4（IL-4 ）和白细胞介素-10 （IL-10）表达水平较正常对照组升高，差异有统计学意义。肿瘤坏死因子-（TNF-）表达水平较正常对照组升高，差异有显著性。结论 胃癌患者体内 Th2 型细胞因子模式占优势状态，这可能是肿瘤细胞发生免疫逃逸，从而导致肿瘤的发生或者转移的原因之一。关键词 胃癌 细胞因子 Th1/Th2 流式细胞术2【Abstract】 Objective To detect the level of Th1and Th2type cytokines of peripheral blood CD3 + T lymphocytes in the patients with gastric cancer.In order to find out the laboratory evidence of tumor immunotherapy.Methods The peripheral blood lymphocytes were stimulated by stimulator in order to enhance expression of cytokines.Specific fluorochrome-conjugated monoclonal antibody combinedwith antigen.Cytokines were detected by flow cytometry and ELISA.Results The level of Th1type cytokines such as interferon-（IFN- ） ，interleukin-2（IL-2） ，interleukin-12（IL-12）were significantly lower in patients of gastric cancer than those of normal controls.The level of Th2type cytokines such as interleukin-4（IL-4 ） ，interleukin-10（IL-10）were higher in patients of gastric cancer than those of normal controls.There were significant difference between them.The levelof tumor necrosis factor a（TNF-）in patients were significant higher than normal control.Conclusion Th1/Th2was imbalance in gastric cancer.Th1type cytokineswere inhibited，and Th2type cytokines were relatively enhanced，so Th1/Th2shiftto Th2.It maybe the mechanism of tumor arising and transferring by 3immune escaped from immunosurveillance. Key words gastric cancer cytokines Th1/Th2 flow cytometry 辅助性 T 细胞（Th）对机体免疫系统有重要的调节作用。人在正常的生理情况下，Th1、Th2 两类细胞处于相互抑制、相互转化的平衡状态，一旦平衡被打破，机体就会处于 Th1 优势或 Th2 优势的漂移状态，从而出现各种病理反应，甚至发生肿瘤 14 。Th1、Th2 细胞这两种细胞均表达 CD3、CD4 抗原 5 ，一般的免疫生化方法不能进一步区分这两种细胞，目前可利用流式细胞仪检测单个特应细胞分泌的特异性细胞因子水平 6 ，分析其免疫细胞活动状态，从而有望研究出调控免疫反应的一套方法。我们应用流式细胞因子水平 6 ，分析其免疫细胞活动状态，从而有望研究出调控免疫反应的一套方法。我们应用流式细胞仪通过Cytodetect TM 试剂盒检测胃癌患者 CD3 + T 细胞分泌细胞因子的表达水平，用酶联免疫吸附（ELISA ）法检测血清中相应的细胞因子水平，分析胃癌患者的 Th1 和 Th2 细胞免疫活动状态，为防治胃癌提供实验依据。1 对象与方法1.1 对象 胃癌 55 例，年龄 4484 岁，平均 62.5 岁，男 43 例，4女 12 例，其中高分化腺癌 19 例，中分化腺癌 16 例，低分化腺癌20 例; 根据国际 UICC 标准 TNM 分期: 期 22 例，期 19 例，期 14 例，所选病例均经临床和病理诊断证实。正常对照 30 例，年龄 4275 岁，平均 58.5 岁，均为健康体检者。1.2 仪器 美国 Coulter EPICSXL 型流式细胞仪，美国 Bio-Rad550 型酶标仪，美国 NAPCO5410 型二氧化碳培养箱，日本三洋 MDF-3820 型-70超低温冰箱，上海安亭科学仪器厂 TDL-5A型离心机。1.3 主要试剂 Cytodetect TM 试剂盒系荷兰 IMMUNO QUALITY PRODUCTS 公司产品。RPMl1640 培养液系美国GIBCO 公司产品。淋巴细胞分离液系上海华精生物高科技有限公司产品。白细胞介素-2（IL-2） 、白细胞介素-4（IL-4 ）和 TNF-ELISA 法检测试剂盒系美国 GeneMay 公司产品。白细胞介素-10（IL-10） 、白细胞介素-12（IL-12）和干扰素-（IFN-）ELISA检测试剂盒系美国 Genzyme 公司产品。1.4 实验方法1.4.1 采集标本 所有患者均在手术前、部分病人在术后 1 个月及化疗后分别抽取静脉血 7ml，其中 2ml 分离血清，-70冻存，用5于细胞因子的 ELISA 法测定 ;5ml 血肝素抗凝，用于 Cytodetect 测定。1.4.2 Cytodetect 测定 采用 Cytodetect TM 试剂盒提供的方法。分离外周血淋巴细胞:采用 Ficoll 密度梯度离心法常规分离外周血淋巴细胞，所分离的淋巴细胞用 RPMl1640 培养液释为 110 6 个细胞/ml 备用。刺激细胞: （1 ）将 1ml 淋巴细胞悬液置于 24 孔培养板，培养孔加 A 试剂 10l，B 试剂 10l，C 试剂 10l。 （2）37，5%CO 2 培养箱孵育 5h。 （3）刺激后转移细胞于一新离心管，加5ml 洗涤剂洗涤，离心（1200r/min10min） ，弃上清液。固定细胞: （1）加 500l 冻固定液（4） ，室温下孵育 10min。 （2）加9ml 洗涤剂洗涤，离心（1200r/min10min） ，倒去上清液，以1ml 洗涤剂悬浮细胞，置 4冰箱过夜。细胞表面抗原染色:（1）从 4冰箱取出固定后细胞液，加 5ml 洗涤剂洗涤，离心（1200r/min10min） ，倒去上清液，以 500l 洗涤剂悬浮细胞。（2）取 100l 细胞悬液，加 20l 抗细胞表面抗原的抗 CD3-FITC，涡旋混匀，室温暗处孵育 20min。细胞打孔 :加 1.5ml 打孔液，离心（1000r/min5min） 。弃上清液，以 100l 打孔液悬浮细胞。细胞因子染色:（1）加 10l 抗细胞因子的单克隆抗体:抗IFN-PE、抗 TNF-PE、抗 IL-2-PE、抗 IL-4-PE、抗 IL-10-PE、抗 IL-12-PE，并另设一管加 10l 该单克隆抗体的同型抗体。（2）4暗处孵育 20min。 （3 ）加 1.5ml 打孔液，离心（1000r/min5min） ，弃上清液，以 100l HBSS 液悬浮细胞，62h 内上流式细胞仪分析。相应的细胞因子检测采用 ELISA 法，严格按说明书进行操作。 1.5 统计学方法 用 SPSS10.0 统计软件对实验数据进行统计学分析，数据以均数标准差（xs）表示，用单因素方差分析对样本均数之间的差异显著性进行检验，用非参数检验的二项检验对计数资料进行检验。2 结果2.1 胃癌患者外周血 CD3 + T 细胞表达 IL-2、IL-4 、IL-10、IL-12、IFN-、TNF- 细胞的百分比 见表 1。胃癌患者 Th1 型细胞因子 IL-2、IL-12 和 IFN- 表达水平较正常对照组显著降低（P0.01） ，而 TNF- 表达水平较正常对照组显著升高（P0.05）;Th2 型细胞因子 IL-4、IL-10 表达水平与正常对照组升高，差异有显著性（P0.05 ） 。2.2 胃癌患者血清细胞因子水平及其与肿瘤分化程度之间的关系 见表 2。结果显示，不同分化程度的胃癌患者血清 IL-2 和 IFN- 与正常对照组相比均显著降低（P0.01 ） ，但各分化程度之间差异无显著性。不同分化程度的胃癌患者血清 IL-4 和 IL-10 水平均显著高于正常对照组（P0.05 ） 。不同分化程度的肿瘤病人血清 TNF-7 显著高于正常对照组（P0.05） 。胃癌组 IL-12 水平低于正常对照组，尤以低分化组降低显著（P0.01 ） 。2.3 胃癌患者血清细胞因子水平及其与临床 TNM 分期之间的关系 见表 3。结果显示，不同临床 TNM 分期的胃癌患者血清 IL-2和 IFN- 与正常对照组相比均显著降低（P0.01） ，各临床 TNM分期之间虽然随着病程的进展有下降的趋势，但差异无显著性。不同临床 TNM 分期的胃癌患者血清 IL-4 和 IL-10 水平均显著高于正常对照组（P0.05 ） 。不同临床 TNM 分期的胃癌患者血清 TNF- 显著高于正常对照组（P0.05） 。胃癌各组 IL-12 水平低于正常对照组，尤以期组降低显著（P0.01 ） 。表 1 胃癌患者与正常人外周血 CD3 + T 细胞表达 IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-、TNF- 细胞的比较 注:与正常对照组比较 P0.01， # P0.05表 2 胃癌患者血清细胞因子水平的变化 注:与正常对照组比较: P0.01， # P0.058表 3 胃癌患者血清细胞因子水平与 TNM 分期的关系 注:与正常对照组比较 P0.01， # P0.053 讨论传统检测 Th1/Th2 细胞的方法，多采用对标本中 T 淋巴细胞进行培养后测定培养上清液中的细胞因子成分，通过计算上述细胞因子的比率而推算 Th1/Th2 细胞频率，此项方法不够精确而且费时。本研究采用荧光标记的抗细胞因子单克隆抗体结合细胞固定、破膜打孔技术，用流式细胞仪来检测单个细胞水平内细胞因子的方法，能够大大地增加对 Th1/Th2 亚群检测的敏感性和特异