免疫胶体金的制备及应用蓝巧玉08 材料科学与工程，海南大学，570228摘要：关键词：1 前言胶体金（Colloidal gold）是一种疏水胶溶液，也称金溶胶（Coldsol）,因其纳米尺寸所具有的独特性质常作为免疫胶体金标记。自1971年，Faulk首次用免疫金标记技术研究沙门菌壁细胞抗原成分，将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。1974年，Romano等用胶体金标记抗球蛋白抗体,建立间接免疫金染色法。1983年，Holgate等建立了免疫金银染色法（LGSS），极大地提高了检测的灵敏度。1989年, Spielberg等通过检测抗 HIV的斑点免疫金渗滤试验,首次建立了斑点金免疫渗滤法 (DIGFA)。1990年，Beggs等在免疫渗滤技术的基础上，建立了一种更加坚毅快速的免疫学检测技术，即胶体金免疫层析法（GLCA），用于检测人尿和血清中的HCG。此后，免疫胶体金标记技术不断成熟，成为继荧光素、放射性同位素和酶之后，又一大免疫标记技术。胶体金作为一种新型免疫标记技术，被广泛应用于电镜水平研究、光显微细胞化学、免疫沉淀以及蛋白质染色技术上，并被引入免疫诊断领域中，尤其在快速诊断方面显示了巨大的前景。胶体金在弱碱环境下，由于带负电，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固 的 结 合 ， 由 于 这 种 结 合 是 静 电 结 合 ， 所 以 不 影 响 蛋 白 质 的 生 物 特 性 。 胶 体 金 除 了 与 蛋 白 质 结 合 以 外 ， 还 可 以 与 许 多 其 它 生 物 大 分 子 结 合 ， 如SPA、 聚 羟 基 脂 肪 酸 酯 （ PHA） 、 伴 刀 豆 球 蛋 白 （ ConA） 等 。 根 据 胶 体 金 的一 些 物 理 性 状 ， 如 高 电 子 密 度 、 颗 粒 大 小 、 形 状 及 颜 色 反 应 ， 加 上 结 合 物的 免 疫 和 生 物 学 特 性 ， 可 以 应 用 于 免 疫 学 、 组 织 学 、 病 理 学 和 细 胞 生 物 学 等领 域 。 胶 体 金 标 记 物 具 有 较 好 的 稳 定 性 、 敏 感 性 、 精 确 性 并 可 人 工 制 备 ，其操作简单、快速和无污染等，另外胶体金标记复合物在干燥状态下室温贮存相当稳定。2 胶体金技术的原理及特点免疫胶体金技术（ICG) )是一种常见的标记技术 ,它是以胶体金为标记物，是利用特异性抗原抗体反应，在光镜电镜下对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术，是继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术。 免疫胶体金技术具有操作方便快捷、灵敏度高、无污染、安全、特异性好、易于判断等优点，可对产品进行定性或定量检测。 【oxLDL 的胶体金免疫层析试纸条的制备 】目前，常用的胶体金技术检测方法主要有：（1）免疫胶体金光境染色法，细 胞 悬 液 涂 片 或 组 织 切 片 ， 可 用 胶 体 金 标 记 的 抗 体 进 行 染 色 ， 也 可 在 胶 体 金标 记 的 基 础 上 ， 以 银 显 影 液 增 强 标 记 ， 使 被 还 原 的 银 原 子 沉 积 于 已 标 记 的 金颗 粒 表 面 ， 可 明 显 增 强 胶 体 金 标 记 的 敏 感 性 。 （2）免疫胶体金电镜法，可用 胶 体 金 标 记 的 抗 体 或 抗 抗 体 与 负 染 病 毒 样 本 或 组 织 超 薄 切 片 结 合 ， 然 后 进行 负 染 。 可 用 于 病 毒 形 态 的 观 察 和 病 毒 检 测 。 （3）斑点免疫金渗滤法（IFA） ，是 以 微 孔 滤 膜 （ 如 膜 ） 作 载 体 ， 其 上 固 定 已 知 的 特 异 性 抗 原 或 抗体 ， 将 其 装 入 特 殊 的 渗 滤 装 置 中 ， 后 加 如 免 疫 金 探 针 发 生 免 疫 ， 检 测 相 应的 抗 原 或 抗 体 。 该 方 法 简 便 、 快 速 、 结 果 直 观 。 （ 4） 胶 体 金 免 疫 层 析 法（ GICA） ， 是 以 微 孔 膜 为 载 体 ， 利 用 微 孔 膜 的 毛 细 管 虹 吸 作 用 ， 如 同 层 析 过程 ， 是 滴 加 在 膜 条 一 端 的 液 体 慢 慢 向 另 一 端 渗 移 ， 使 标 本 中 的 抗 原 与 免 疫 金探 针 结 合 生 成 免 疫 金 复 合 物 并 被 固 相 载 体 捕 获 呈 现 红 色 的 控 制 线 条 。 整 个 检测 过 程 操 作 简 单 、 试 剂 少 、 快 速 ， 可 通 过 肉 眼 观 察 打 显 色 结 果 。 该 法 现 已发 展 成 为 诊 断 纸 条 ， 使 用 十 分 方 便 ， 对 动 物 及 人 体 检 疫 的 快 速 诊 断 很 有 影响 力 。【 胶 体 金 标 记 技 术 在 免 疫 分 析 中 的 研 究 进 展 】3 胶体金的制备原理及方法3.1 胶体金的制备原理胶体金是由 氯 金 酸 (HAuCl4)在 还 原 剂 如 白 磷 、 抗 坏 血 酸 、 枸 橼 酸 钠 、 鞣酸 等 作 用 下 ， 可 聚 合 成 一 定 大 小 的 金 颗 粒 ， 并 由 于 静 电 作 用 成 为 一 种 稳 定 的胶 体 状 态 ， 形 成 带 负 电 的 疏 水 胶 溶 液 ， 由 于 静 电 作 用 而 成 为 稳 定 的 胶 体 状 态 ，根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备 5 - 150 nm 不等的胶体金颗粒，一般还原剂用量越大制备的胶体金颗粒越小。 胶体金标记物又被称为胶体金结合物、胶体金探针或免疫金。被标记物须经过彻底除盐的预处理，而制备稳定的胶体金结合物受多种因素影响，如金颗粒大小、离子浓度、被标记物用量及标记体系的pH值等。最适pH值一般接近或略大于被标记物的等电点，而被标记物的用量取决于金颗粒的大小。3.2 胶体金的制备方法胶体金的制备方法有很多种，如溶液还原法、电化学法、微波法等，但化学还原法具有操作简单、设备简单等优点，一般都采用化学还原法，其主要有白磷还原法、抗坏血酸还原法、柠檬酸三钠还原法、鞣酸原柠檬酸三钠还原法、乙醇超声波还原法和硼氢化钠还原法。常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。由于白磷易燃易爆，一般实验室不宜采用。采用化学还原法制备胶体金时，通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例（增加或减少还原剂的量）可得到所需不同直径的金颗粒。但制备的胶体金颗粒分散性不是很好，还需要进一步的改进。2010年，高燕红等首次通过改进的方法，将聚乙烯吡咯烷酮（PVP）做稳定化试剂，用硼氢化钾化学还原法和晶种生长法结合，制备出具有良好分散性、无团聚现象及粒径均匀的胶体金和金纳米棒。4、胶体金的应用随着纳米技术的发展，免疫胶体金技术的应用越来越广泛，如胶体金探针、免疫胶体金试纸，以及在光境电镜上的使用等，使得免疫胶体金技术在食品安全、生物医用等领域得到广泛的应用。4.1 胶体金在医学中的应用4.1.1、胶体金在电镜水平的应用胶体金应用电镜水平的研究最早，发展最快，应用最广泛。其最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。直径为315nm 胶体金均可用作电镜水平的标记物。315nm 的胶体金多用于单一抗原颗粒的检测，而直径 15nm 多用于检测量较多的感染细胞。 胶体金用于电镜水平的研究，主要包括：细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察，单层培养中细胞内抗原的检测，组织抗原的检测。4.1.2、胶体金在光镜水平的应用胶体金同样可用做光镜水平的标记物，取代传统的荧光素、酶等。各种细胞涂片、切片均可应用。主要用于：用单克窿抗体或抗血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表面抗原。检测培养的单层细胞胞内抗原，组织中或亚薄切片中抗原的检测。4.1.3、凝集试验：单分散的免疫金溶胶呈清澈透明的溶液，其颜色随溶胶颗粒大小而变化，当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒极度增大，光散射随之发生变化，颗粒也会沉降，溶液的颜色变淡甚至变成无色，这一原理可定性或定量地应用于免疫反应。此外，胶体金在流式细胞仪，免疫印痕技术，免疫层析快速诊断技术，胶体金早孕检测试纸也有很广泛的应用。4.2 在禽病检疫中的应用随着世界范围内养禽业的规模不断扩大，禽病对养殖的危害也随之加剧。对家禽疾病进行有效防治的关键是快速准确地进行诊断并弄清致病因子。伴随着病原检测技术的进步，免疫胶体金技术以其快速、简便、可单份检测、灵敏度高、特异性强、稳定性好、检测标本种类多等优点开始被逐渐应用于禽病的病原诊断。 郝桂兰、王长美等人利用免疫胶体金试验，成功实现了对禽型副黏病毒病的快速鉴别诊断。郑鸣等用胶体金标记抗原，运用双抗原夹心法于国内首先建立了猪瘟病毒抗体检测免疫层析试纸条。刘春龙等建立了检测牛初乳中免疫球蛋白( IgG) 含量的免疫胶体金法，并与常用的免疫单扩散法进行了比较。结果表明，免疫胶体金法灵敏度为200 g/mL，操作简单快速，不需要特殊仪器和设备，适合现场的快速检测。李恪梅等用布鲁菌纯蛋白衍化物作为该检测板的包被抗原，建立了用胶体金标记抗原，利用间接法检测人和不同动物血液样品中的抗布鲁菌抗体的新方法。 王中力等采用柠檬酸三钠法制备胶体金颗粒，标记纯化的犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)单克隆抗体。徐葛林等采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒标记抗狂犬病病毒单抗，制成免疫层析试纸条。4.3 在水产养殖业中的应用随着我国水产集约化养殖业的迅速扩大，El趋严重的病害威胁已经成为影响产业发展的主要瓶颈之一；与此同时，随着人们对于食品安全和环境保护意识的不断增强，选择科学合理、绿色环保的养殖模式已是今日养殖业发展的主要方向。4.3.1 胶体金免疫层析技术（GICA ）在水生动物检疫中的应用GICA 作为一种可靠的免疫学检测技术，特异性强、灵敏度高、简便快速、无需特殊仪器设备，在动物检疫工作中广泛用于传染病病源微生物的抗原、抗体检测。目前已有少量兽医用商品 GI2CA 试纸条生产，可是还未有水产用的商品 GICA 试纸条。武汉大学的孟小林等发明了一种检测对虾白斑综合症病毒的试纸条制备方法，并申请了专利。很多学者也对单增李斯特菌、沙门氏菌、大肠埃希菌 O157:H7 等的胶体金免疫层析检测技术进行了研究。制备各种疾病的试纸条，在方法上是可行的，随着研究工作的开展，可望将 GICA 技术广泛用于各种水产养殖疾病的快速诊断和检测。届时，养殖户在购入苗种时可用GICA 试纸条自行检测，以挑选健康合格的苗种。 4.3.2 胶体金免疫层析技术在水产品质量检测中的应用 水产品质量安全越来越受到消费者的关注，各级政府部门都在加大质量监督的力度。传统的液相、液质、气相等方法虽然灵敏度高、检测结果准确可靠，但是检测周期长、费用高，不能完全符合市场化的需求。现在很多城市都在水产品批发市场建设了快速检测中心。目前市场上也已有很多水产品抗生素残留、农药残留的 GICA 试纸条在销售，如氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、喹诺酮类、四环素类、有机磷农药等。很多参数的检测灵敏度也足够满足限量要求，如有些厂家生产的氯霉素试纸条灵敏度可达到 0.1ng/mL，而限量是 0.3ng/mL，检测时间基本在 20min30min，比 ELISA（酶联免疫吸附法）还快两个小时左右。 4.3.3 胶体金免疫层析技术在水产养殖投入品检测中的应用 很多水产品质量问题是由饲料等投入品的问题引起的，如抗生素、激素等违禁药物的添加，此外也存在由于生物毒素等引起的质量问题。投入品的质量问题增加了水产品质量风险，影响到消费者的健康和养殖户的切身利益。为了从源头上控制水产品质量安全，政府部门也逐渐开始着手投入品的质量监控。目前，很多专家学者也正在建立激素、生物毒素等的 GICA 检测法。饲料真菌毒素是普遍存在的，黄曲霉毒素是一种致毒性和致癌性