1KOH 涂片镜检法诊断真菌性角膜炎的意义作者：杨莉萍，黄文明，樊翌明，李瑞庄 【关键词】 KOH 涂片 【摘要】目的:探讨 KOH 涂片镜检法对真菌性角膜炎的诊断意义，了解湛江地区真菌性角膜炎的病原学。方法:取 102 例真菌性角膜炎患者的角膜溃疡标本，作 KOH 涂片镜检、真菌培养及菌种鉴定。结果:KOH 涂片镜检法和真菌培养法的阳性率分别为97.1（99/102） 、94.9（93/98） ，二者的真菌检出率差异无显著性（P0.05） 。93 份培养阳性标本中，共分离出 18 属 33 种真菌，其中镰刀菌属、弯孢霉属和曲霉属真菌分别占36.6%、27.9%、7.5%。结论:KOH 涂片镜检法是早期诊断本病的简单、有效方法。镰刀菌和弯孢霉是湛江地区真菌性角膜炎的主要致病菌。 【关键词】角膜炎；真菌；培养 【Abstract】 Objective: To investigate the diagnostic value of potassium hydroxide based smear assay for mycotic keratitis and the pathogenic spectrum in Zhanjiang area. Methods: The corneal scrapings from 102 patients with fungal keratitis were subjected to 10% KOH based smear before microscopic observation, fungal culture and strain 2identification. Results: The positive rates of fungal infection of fungal keratitis detected by KOH based smear and fungal culture were 97.1% (99/102) and 94.9% (93/98), respectively, and there was no significant difference in the fungal detection efficiency between the two methods (P0.05). The pathogenic fungi belonged to 18 genus and 33 species； of which, Fusarium, Curvularia and Aspergillus accounted for 36.6%, 27.9% and 7.5%, respectively. Conclusion: The KOH based smear is simple and effective in the early diagnosis of fungal keratitis. Fusarium and Curvularia are the predominant pathogens of mycotic keratitis in Zhanjiang district. 【Key words】 keratitis; fungus; culture 真菌性角膜炎的患病率在我国呈逐年上升趋势，其致病菌迄今已多达 70 种1 。真菌性角膜炎的处置不当将导致角膜穿孔、失明甚至眼球摘除，而治疗的成功和视力的恢复取决于早期、快速、正确的诊断。虽然 KOH 涂片镜检法目前仍是发展中国家快速诊断真菌性角膜炎的主要检测方法，但国内有关其对本病的诊断意义的报道少见26 。本文分析了我院 2003 年 10 月2005 年 12 月间诊治的 102 例真菌性角膜炎的真菌学检查结果，旨在了解 KOH 涂片镜检法对真菌性角膜炎的诊断意义。 1 资料与方法 1.1 病例资料 3102 例患者中，男 71 例，女 31 例，年龄 685 岁（平均 48.7岁） ，病程 360 d（平均 13.9d） ；均为单眼患病，其中右眼 55 例，左眼 47 例；农民 89 例，工人 9 例，学生 4 例。58 例有明确的眼外伤史，引起外伤的异物为谷粒或谷尘（20 例） 、可疑尘埃（20 例）、泥土（5 例） 、木屑（ 4 例） 、甘蔗叶（3 例） 、焊屑（2 例） 、水泥粉（1 例） 、竹片（1 例） 、橘叶（1 例） 、草刺伤（1 例） 。 1.2 标本采集 1%的卡因行患眼表面麻醉，2 min 后在无菌操作下用手术刀刮取角膜溃疡组织，置于含少量灭菌生理盐水的无菌离心管中送检。 1.3 KOH 涂片镜检 用无菌白金耳挑取适量送检的角膜溃疡组织置于载玻片上，涂片时尽量将角膜组织薄层铺开，加 1 滴 10% KOH 液，盖上盖玻片，显微镜下查找真菌。 1.4 真菌培养 将余下的角膜溃疡组织接种于 2 支沙氏培养基（SDA）试管斜面上，27 培养 2 3 周，观察有无真菌生长。 1.5 菌种鉴定 2 支 SDA 试管中均有真菌生长，且菌落形态一致者，初步确定其为致病菌。取其菌落移种于葡萄糖马铃薯琼脂（PDA）或察氏培养基平皿上，27 培养 2 周，观察其生长形态及速度；同时将菌落移种于 PDA 或察氏培养基行微量培养，每天镜下观察真菌菌丝和分生孢子生长情况。根据菌落颜色、形态、生长速度及有无液体渗出，4以及菌落涂片和微量培养镜下菌丝颜色、形态和分生孢子的形态、结构及产孢方式等特点，进行菌种鉴定78 。 1.6 统计学处理 采用配对卡方检验。 2 结果 102 份角膜溃疡标本中均检出真菌，其中 4 份因缺乏标本而未作真菌培养。KOH 涂片镜检 102 份，其中阳性 99 份（97.1） ，阴性 3 份（2.9） ；真菌培养 98 份，其中阳性 93 份（94.9） ，阴性 5 份（5.1） （表 1） 。在 KOH 涂片镜检阴性的 3 份标本中，真菌培养分离出面包串珠霉菌、顶套菌和丛生菌各 1 例。真菌一般在34 d 内开始生长，但培养基需要保存 46 周。93 份培养阳性标本中，共分离出 18 属 33 种真菌，其中以镰刀菌属、弯孢霉属和曲霉属真菌多见（表 2） 。表 1 98 份角膜溃疡标本中 KOH 涂片镜检法与真菌培养法结果的比较表 2 93 例真菌性角膜炎的致病真菌分类 3 讨论 虽然临床表现有助于真菌性角膜炎的诊断，但明确诊断依赖于实验室检查，如角膜刮片或活检标本直接镜检、染色检查、组织病理检查、真菌培养、共焦显微镜和 PCR 技术23 。尽管真菌直接镜检不能鉴别感染的菌种，但其是快速诊断真菌性角膜炎的重要方法。以真菌培养为标准，KOH 涂片镜检法对真菌性角膜炎的敏感度为72.291，Gram 染色为 31.698.0 ，Giemsa 染色为27.085.0，calcofluor white （CFW ）染色为580.090.0，PAS 染色为 91.0，六胺盐染色为56.089.0，乳酚棉蓝（lactophenol cotton blue）染色为70.080.0，吖啶橙染色为 65.023 。共焦显微镜检查和PCR 技术尽管在本病的诊断中已显示出良好的应用前景，但还有许多问题需进一步研究。 KOH 涂片镜检法诊断真菌性角膜炎的敏感性为 81.2，特异性为 83.84 ；其与真菌培养法结果的阳性一致率为82.090.05 。本文结果显示 KOH 涂片镜检法对真菌的检出率高达 97.1，其与真菌培养法的检出率差异无显著性。因此，KOH 涂片镜检法具有简单、快捷、价廉、结果可靠的优点，可作为早期诊断真菌性角膜炎的主要方法。高倍镜下见到无色透明的菌丝可初步考虑为丝状真菌感染，而见到无色、折光性强、大小不一的孢子则考虑为酵母菌感染。由于真菌具有向角膜组织内生长的特性，故在取材时要先擦除表面的坏死组织，再用刀片反复刮取角膜溃疡底部和边缘组织。另外，在涂片时要尽量将角膜组织薄层铺开，这样可更清晰地显示真菌菌丝和孢子。 由于真菌培养可提高病原体的检出率、鉴定菌种和进行药敏试验，故其目前仍是诊断真菌感染的“金标准” 23，5 。虽然改良 SDA培养基足以分离出各种不同的眼部真菌，但最好联合应用固体和液体培养基分别在 37、2530环境下进行培养2 。Rosa等9用改良 SDA 培养基进行真菌性角膜炎患者的角膜刮片培养，发现培养阳性率为 90，2 d、3 d 和 1 周内的阳性率分别为654.0、83.0、97.0。病例的选择是影响真菌培养阳性率的主要因素，如化脓性角膜炎的阳性率为 20.050.0，真菌性角膜炎为 50.080.05 ，本文则高达 94.9。在本组病例中，有3 例患者作直接镜检阴性，但真菌培养阳性。因此，对于可疑的真菌性角膜炎患者，均需同时作 KOH 涂片镜检和真菌培养与鉴定，有条件者还应作药敏试验，从而避免漏诊和指导治疗。 虽然真菌性角膜炎的致病菌存在明显的地域性差异，但其种类在过去的 20a 中并未发生明显的变化 3 。丝状真菌和暗色真菌（弯孢霉属、离蠕孢属）是其主要致病菌，而酵母和酵母样真菌较少见2 。Gopinathan 等6 总结了印度南部 1352 例真菌性角膜炎患者的实验室检查结果，发现镰刀菌属、曲霉属和弯孢霉属分别占37.2、30.7、2.8 。国内调查显示：华北地区和郑州地区真菌性角膜炎的致病菌属相同，依次为镰刀菌属、曲霉属和青霉属；华南地区在 19751986 年期间的主要致病菌依次为曲霉属、镰刀菌属和青霉属，而 19891997 年期间则变为镰刀菌属、曲霉属和弯孢霉属10 。本组病例的主要致病菌依次为镰刀菌属、弯孢霉属和曲霉属，镰刀菌属中以茄病镰刀菌最多见。虽然湛江地区在地理位置上与广州较接近，但本文所见的弯孢霉属明显多于宋书华等5的报道，而曲霉菌属较少见。 参考文献: 1 王丽娅，孙声桃，张月琴，等. 河南地区真菌性角膜病致病菌种调查J. 中国实用眼科杂志，2003，21（3）：224225. 7 2 THOMAS P A. Current perspectives on ophthalmic mycoses J . Clin Microbiol Rev, 2003, 16(4): 730797. 3 SRINIVASAN M. Fungal keratitis J. Curr Opin Ophthalmol, 2004, 15(4): 321327. 4 SHARMA S, SILVERBERG M, MEHTA P, et al. Early diagnosis of mycotic keratitis: predictive value of potassium hydroxide preparation J . Indian J Ophthalmol, 1998, 46(1): 3135. 5 宋书华，林跃生，黎明，等. 真菌性角膜炎的病原学分析J. 中国实用眼科杂志，2005，23（5）：506508. 6 GOPINATHAN U, GARG P, FERNANDES M, et al. The epidemiological features and laboratory results of fungal keratitis: a 10year review at a referral eye care center in South India J . Cornea, 2002, 21(6): 555559. 7 孙鹤龄. 医学真菌鉴定初稿 M. 北京: 科学出版社, 1987. 8 叶世泰, 乔秉善,