The Transcriptome and DNA Methylome Landscapes of Human Primordial Germ Cells,人类原始生殖细胞的转录组和DNA甲基化组概观,研究目的,深入研究人类多个发育阶段原始生殖细胞（PGC）的转录组和DNA甲基化组，以及蛋白质共价修饰，发现人类原始生殖细胞不同于小鼠原始生殖细胞的关键独特特征。,研究背景,基因组DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰方式，是调控细胞分化发育过程中基因表达的主要机制之一，它并不改变基因序列，但是可以遗传给后代，容易受外界环境的影响而发生改变，在胚胎发育、干细胞分化、癌症发生等方面发挥着重要的作用。 人类胚胎在发育过程中有两轮大规模的DNA甲基化组重编程发生。第一轮发生在受精后的植入前胚胎中，第二轮发生在植入后的生殖细胞中。,2014年，团队采用高灵敏度的DNA甲基化组高通量测序技术，首先对人类植入前胚胎的DNA甲基化图谱进行了单碱基分辨率的、全基因组测序分析，发现人类精卵结合后，早期胚胎的基因组DNA发生大规模的去甲基化，甲基化程度从精子中的86%（中位数）降低到囊胚期胚胎中的43%，而在这一过程中印记基因控制区域的DNA甲基化得以精确的维持。在植入后的胚胎中，基因组DNA被大规模重新甲基化，DNA甲基化水平增加到92%。该项研究还发现了DNA甲基化组重编程对于基因表达网络的关键调控特征。,在此基础上，该研究团队对人类胚胎中第二轮DNA甲基化组重编程过程及其对基因表达网络的调控关系进行了深入、全面的分析。在正常情况下，一个植入后胚胎内大部分组织器官的基因组DNA加上甲基化标记后就基本维持稳定、不再擦去，而含有要传递给后代遗传信息的原始生殖细胞则要经历大规模的DNA甲基化擦除和重建的过程。,利用精细的流式细胞分选技术对于不同发育阶段以及不同性别的人类原始生殖细胞进行了分选、收集，再结合单细胞转录组高通量测序、微量细胞DNA甲基化组高通量测序、微量细胞DNA羟甲基化组高通量测序等技术、以及细胞免疫荧光技术，对人类原始生殖细胞的转录组、DNA甲基化组、以及组蛋白共价修饰等关键特征进行了深入的分析,原生殖细胞的转录描述,原生殖细胞的转录描述,在7周和19周的通过FACS(流式细胞仪)得到KIT（一种原癌基因）基因表达活性高的原生殖细胞和对应的性腺体细胞，通过研究它们的RNA序列并进行对比，发现原生殖细胞RNA的转录量远远高与性腺体细胞,总的来说从不同时期的不同个体中得到了233个原生殖细胞和80个性腺体细胞和11个胚囊内细胞，将他们放在一起发现。,4周到11周的原殖细胞会混合在一起，但是会很明显的和性腺体细胞分开。17周大的雌性原生殖细胞和19周大的雄性原殖细胞会脱离原殖细胞群。然而四周大的胚囊内细胞还是可以和这两种细胞混在一起，猜测这种细胞有可能是造血干细胞的前体。,图中PC1表示有丝分裂和减速分裂的差异，4-11周的原殖细胞和胚囊内细胞细胞混在一起，但是17周的雌原殖细胞和19周的雄原殖细胞有了不均匀的分散，表明开始进行减速分裂，而且雌原殖细胞比雄原殖细胞的分散更不均匀，说明减速分裂比有丝分裂更具有不均一性。,人类的原殖细胞并没有和小鼠相似的SOX2蛋白这一点在基因的表达量上可以证明：,通过基因在不同时期不同细胞的表达量的不同可以发现基因在不同阶段的特异性表达。,通过发现有的性腺体细胞表达与卵丘细胞和支持细胞形成有关的WT1基因推断这些性腺体细胞会发展为卵丘细胞和支持细胞，但是发现这些细胞表达某些原癌基因，推断这些细胞包含了不同种类的子细胞群。,接下来研究了和细胞多能性有关基因在原生殖细胞中的表达，发现从4周到19周原殖细胞在的多能性有关基因的表达量在下降，与此相反，17周以后的雌原殖细胞的减速分裂有关基因的表达量有了很明显的增加，表明17周的雌原殖细胞已经进入减速分裂。,原殖细胞在胚胎表达中的不均一性,为了从同一个胚胎中分析原殖细胞的不均一，通过分析多个原殖细胞基因转录的平均值，再把单个细胞和这个平均值进行比较，发现某些基因的表达具有明显的不均一性。,原殖细胞激活X染色体,通过研究X染色体的表达量发现X染色体在雌性原殖细胞第四周就已经开始被激活。,此外，通过研究X染色体的等位基因发现一些基因在性腺体细胞中只表达了等位基因中的其中一个，而在雌原殖细胞中却表达了一对等位基因,Globle Demethylation Pattern,Dynamic Methylome Analysis of Human PGCs Revealed a Globle DNA Hypomethylation Pattern,Major demethylation before 7 weeks,lowest,WGBS ： 全基因组重亚硫酸盐测序,A week earlier,Remet.after 19 weeks,Remet.after 17 weeks,Dynamic Methylome Analysis of Human PGCs Revealed a Globle DNA Hypomethylation Pattern,Slightly higher of methylation,Dynamic Methylome Analysis of Human PGCs Revealed a Globle DNA Hypomethylation Pattern,Difference between DNA methylation,Dynamic Methylome Analysis of Human PGCs Revealed a Globle DNA Hypomethylation Pattern,Marginal level,Dynamic Methylome Analysis of Human PGCs Revealed a Globle DNA Hypomethylation Pattern,Demethylation through oxidation to 5hmC,The Methylation Dynamics of Imprinting Genes and Germline-Spercific Genes in Human PGCs,Re-establishment of imprinting after that,The Methylation of Functional Genomic Elements in Human PGCs,Avoiding transmission of these epigenetic memories to later germ cells and next generation individuals,The Methylation of Functional Genomic Elements in Human PGCs,Still 36.5%,Basis for potential trans-generation inheritance of epigenetic memory,Relationship Between DNA Methylation and Gene Expression,结论与讨论,（Result and discussion）,（一）作者发现在4周的胚胎到11周胚胎的7周内，原始生殖细胞的转录组变化比较稳定，仅有几百个基因的表达发生显著变化。,4 week11 week,但是此时甲基化水平却急剧下降。 可能是为接下来分化基因的表达做好准备。,甲基化水平,（二）性腺体细胞表达谱发生很大的变化，说明此时细胞已进入分化阶段。,造血干细胞,（三）第17周减数分裂的雌性原始生殖细胞不仅与其有丝分裂的前体细胞转录组差异大，而且细胞之间的差异也很大。说明此时的原始生殖细胞正在进行活跃的生命活动。（分裂或分化）,（四）雌性的原始生殖细胞中失活的X染色体在第4周时开始被激活。,在此相同阶段，雌性X染色体基因的表达水平并不是雄性的2倍，而是1.6倍，这说明在雄性中X染色体的表达活性被提高或者雌性X染色体的表达活性被抑制了。,（五）原始生殖细胞中发生了活跃的碱基切割修复（base excision repair (BER)pathway） 这可能与基因组的去甲基化有关。,（六）第二轮去甲基化水平比第一轮去甲 基化更彻底。增强子表现更显著。,第一次去甲基化,第二次去甲基化,增强子,这样彻底的去甲基化将在一定程度上阻止DNA修饰的传递。,（七）在第二次去甲基化中，分子进化上更久远的原件甲基化水平更低，也就是说分子进化上时间更短的原件甲基化残留水平越高,In Summary,In summary, the transcriptome （转录组）and DNA methylome（甲基化） landscapes of human migrating（迁移） and gonadal（性腺） PGCs（原始生殖细胞） are in general similar（大致相同） to those of mouse PGCs at comparable stages. At the same time, human PGCs also show unique features（独特的特征） different from mouse PGCs. Our work paves the way to elucidating（阐明） the complex relationship of DNA methylation and the gene expression network during the global epigenetic reprogramming process（表观遗传的重新编码过程） of human PGCs.,从转录组研究基因表达网络与DNA甲基化的关系得出：人体原始生殖细胞去甲基化为基因的表达和表观遗传的重新编程做好准备。,Thats All！Thanks,Reference：Fan Guo, Liying Yan，etc. The Transcriptome and DNA Methylome Landscapesof Human Primordial Germ CellsJCell.2015.6.5:1437-1452.,