分类号 密级国际十进分类号（UDC）第四军医大学学 位 论 文Cajal间质细胞培养、传代及胃动素受体的表达（题名和副题名）许文达（作者姓名）王宝西教授（主任医师）指导教师姓名第四军医大学唐都医院儿科指导教师单位申请学位级别论文提交日期论文起止时间学位授予单位硕士 儿科学专业名称答辩日期2011.04 2011.05 2009 年 10 月至 2011 年 4 月第四军医大学 独 创 性 声 明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名： 日期：保 护 知 识 产 权 声 明本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容（含电子版，保密内容除外），可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库和编入中国知识资源总库，同意按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。论文作者签名： 导师签名： 日期： Cajal间质细胞培养、传代及胃动素受体的表达研究生：许文达 学科专业：儿科学所在单位：第四军医大学唐都医院儿科导 师： 王宝西教授（主任医师）资助基金项目：关键词：Cajal间质细胞；传代；冻存与复苏；胃动素受体中国人民解放军第四军医大学二 O一一年四月 第四军医大学硕士学位论文目录缩略语表 . 1中文摘要 . 4英文摘要 . 7前 言 . 11文献回顾 . 12一、 Cajal 间质细 胞的研究现状. 12二、胃动素受体的研究现状. 22正 文.27实验一 C AJAL间质细胞的分离培养、传代、冻存与复苏 . 271材料. 272方法. 283结果. 304讨论. 32实验二 C AJAL间质细胞胃动素受体的表达 . 341材料. 342方法. 353结果. 374讨论. 42小 结 . 44参考文献 . 45个人简历和研究成果 . 56致 谢 . 57 第四军医大学硕士学位论文缩略语表缩略词5-HTAch英文全称 中文全称5-hydroxytryptamineAcetylcholine5-羟色胺乙酰胆碱ANO1EMAnoctamin 1 钙激活氯离子通道红霉素ErythromycinGHS Growth hormone secretagogues 生长激素促分泌素生长激素促泌素受体GHS-R Growth hormone secretagoguereceptorGPCRGPR38ICCG proteln- coupled receptors G蛋白偶联受体G蛋白偶联受体 38Cajal间质细胞G protein-coupled receptor 38Interstitial cell of cajalICC-CM ICC of the circular muscle 环形肌内的 Cajal间质细胞ICC-DMPICC-IMDeep muscular plexus ICCIntramuscular ICC深肌丛 Cajal间质细胞肌内 Cajal间质细胞ICC-LM ICC of the longitudinal muscle 纵形肌内的 Cajal间质细胞ICC-MP/ICC-MYICC-SEPICC of the myenteric plexus/ Myenteric肠肌丛 Cajal 间质细胞plexus ICCICC of the septa 间隔内的 Cajal间质细胞ICC-SM ICC of submucosa and submucosal plexus粘膜下和粘膜下神经丛 Cajal间质细胞IGF-1R Insulin-like growth factor 1 receptor 胰岛素样生长因子1受体-1- 第四军医大学硕士学位论文IP3 Inositol triphosphate 三磷酸肌醇IP3R Inositol triphosphate receptorMotilin三磷酸肌醇受体胃动素M oMLCKMLCPMMCMyosin light-chain kinase 肌球蛋白轻链激酶肌球蛋白轻链磷酸酶移行性运动复合波胃动素受体Myosin light-chain phosphataseMigrating motor compexesMotilin receptorMTL-RMTLR-PLC-IP3 Motilin-receptor-PhospholipaseC-Inositol triphosphate胃动素受体-磷脂酶 C-三磷酸肌醇NK1RNSFNeurokinin 1 receptor 神经激肽-1受体N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein N-乙基顺丁烯二 酰亚胺敏感性的融合蛋白PKAPKCPLCProteinkinaseA 蛋白激酶 A蛋白激酶 C磷脂酶 CProteinkinaseCPhospholipase CPSD Postsynaptic DensityRyanodine receptorStem cell factor突触后致密物阿诺碱受体干细胞因子平滑肌细胞RyRSCFSMCSNARESmooth mucle cellsoluble NSF attachment protein receptor 可溶性 NSF附着蛋白受体慢波SW Slow waveTRP Transient receptor potential 瞬时受体势-2- 第四军医大学硕士学位论文UC Ulcerative colitis 溃疡性结肠炎肠血管活性肽VIP Vasoactive intestinal peptide-3- 第四军医大学硕士学位论文Cajal间质细胞培养、传代及胃动素受体的表达硕士研究生：许文达导 师：王宝西教授第四军医大学唐都医院儿科，西安 710038中文摘要实验背景ICC是广泛分布于胃肠道平滑肌和神经丛的一类特殊类型间质细胞。研究证实其主要功能有1,2：1、胃肠道慢波活动的起搏细胞；2、促进电活动的传导；3、介导胃肠神经和平滑肌之间信号传导；4、作为牵张感受器协调机械压力的输入。许多胃肠动力障碍性疾病与 ICC的异常变化有关。因此，在胃肠道把ICC作 为治疗和研究的靶目标很有现实意义。但是体外分离和培养 ICC仍存在许多不确定因素，尤其是长期培养 ICC的可行性及 ICC的生物学特性等问题仍然不能解释清楚。有关 ICC的培养、传代、冻存及复苏也未见报道，因此摸索 ICC长期培养的条件，了解细胞生物学特性，为持续性研究ICC功能打下基础。近来研究显示在 ICC上已经发现了十余种类型的受体,包括：胆囊收缩素受体 A3、G蛋白偶联受体（PKA,PKC ）4、胆碱能（M2,M3）受体 5、神经激肽（NK1 ,NK3）受体6、嘌呤能（P2Y1, P2Y4,P2X2, P2X5）受体7,8、五羟色胺(5-HT, 5-HT3, 5-HT4)受体9,10型药物研发有重要的指导意义。-4-等。受体的研究对诠释细胞功能及新 第四军医大学硕士学位论文胃动素是由22个氨基酸组成的单链脑肠肽，主要由十二指肠和空肠黏膜上皮 Mo内分泌细胞分泌。其生理作用是来调节 胃肠移行性运动复合波(MMC)。而胃动素调节胃肠活动的机制一个重要突破口就是胃动素受体的分布及受体后信号通路的研究。根据目前报道胃动素受体在不同物种的胃肠平滑肌细胞和肠神经元均有表达 11,12,13,14,15,16,17,18。而作为胃肠功能单位“神经-ICC -平滑肌” 网络中 ICC是否会存在胃动素受体表达？我 们先前的关于 ICC 在胃动素受体激动剂诱导平滑肌收缩中作用机制的研究显示ICC可能存在胃动素受体表达。19实验目的本研究目的就是探讨 ICC的培养、冻存与复苏、传代的条件，了解细胞的生物学特性；分别从细胞形态学、基因和蛋白水平来验证 ICC上是否存在胃动素受体的表达。实验方法第一部分：以兔小肠为 ICC组织来源，应用胶原酶消化法分离、培养ICC；特异的 c-kit 抗体对 ICC进行免疫荧光鉴定；对细胞进行传代培养；摸索细胞冻存和复苏的条件；用 MTT法测定传代后 细胞生长曲线。第二部分：新鲜分离的细胞和培养15天的细胞分别进行流式细胞分析c-kit阳性 细胞比率， 选用阳性率高的方法 进行 ICC 的分选；以流式细胞仪分选的 ICC为靶细胞，分别采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）技术。将提取的细胞总 RNA和总蛋白，进行分析检测；应用特异性 c-kit蛋白抗体、胃动素受体抗体(anti-GPR38) 以及细胞核染料（hoechst33342）