硕士学位论文论 文 题 目 CD133 分 子 对 脑 胶 质 瘤 细 胞 生 物 学 行 为的 作 用 研 究研 究 生 姓 名 马 晓 花指 导 教 师 姓 名 张 学 光专 业 名 称 免 疫 学研 究 方 向 肿 瘤 免 疫论 文 提 交 日 期 2013 年 04 月1指导小组成员葛彦博士居颂光副教授2CD133 分子对脑胶质瘤细胞生物学行为的作用研究 中 文 摘 要中 文 摘 要肿 瘤 干 细 胞 是 指 在 肿 瘤 中 组 织 少 量 存 在 的 一 群 具 有 自 我 更 新 和 分 化 潜 能 的 肿瘤 细 胞 。 先 后 急 性 髓 性 白 血 病 、 乳 腺 癌 、 脑 癌 、 肠 癌 、 黑 色 素 瘤 等 多 种 肿 瘤 中 发现 了 肿 瘤 干 细 胞 ， 该 细 胞 亚 群 是 肿 瘤 发 生 、 复 发 、 转 移 的 根 源 ， 为 肿 瘤 的 诊 断 和治疗提供了新靶点。脑 胶 质 瘤 是 颅 内 常 见 的 肿 瘤 类 型 ， 恶 性 程 度 高 、 术 后 易 复 发 、 病 人 预 后 差 。2003 年 ， Singh 等首次发现了脑瘤干细胞，并将 CD133 分 子 作 为 脑 瘤 干 细 胞 特 异性 的 标 志 分 子 。 此 后 ， 诸 多 研 究 表 明 CD133+脑 胶 质 瘤 干 细 胞 与 肿 瘤 的 分 级 预 后 、血 管 形 成 、 高 度 耐 药 性 、 放 /化 疗 耐 受 等 许 多 恶 性 行 为 有 关 ， 但 CD133 分 子 具 体 的生物学功能和作用机制还有待深入研究。鉴 此 ， 本 研 究 通 过 基 因 转 染 的 方 法 构 建 了 一 株 稳 定 表 达 CD133 分 子 的 脑 胶 质瘤 细 胞 株 ， 并 对 其 生 长 、 细 胞 周 期 、 神 经 球 形 成 、 干 细 胞 相 关 基 因 表 达 、 裸 鼠 体内致瘤性等生物学性质进行了分析。第一部分 人 CD133 基 因 转 染 脑 胶 质 瘤 细 胞 株 的 建 立【目的】构建稳定表达人 CD133 分子的脑胶质瘤细胞株。【 方 法 】 构 建 含 人 CD133 全 长 cDNA 的 逆 转 录 病 毒 表 达 载 体 ， 采 用 脂 质 体 法将重组质粒及其辅助载体导入 293T 细 胞 包 装 逆 转 录 病 毒 ， 进 而 感 染 脑 胶 质 瘤 细 胞株 U251， zeocin 加 压 筛 选 ， 流 式 细 胞 术 、 细 胞 免 疫 化 学 及 Real Time PCR 检 测 CD133分子的表达；同时构建 pEGZ-Term 空 载 体 转 染 的 对 照 细 胞 株 U251-mock。【 结 果 】 成 功 构 建 高 表 达 CD133 分子的脑胶质瘤细胞株 U251-CD133。【 结 论 】 成 功 构 建 了 高 表 达 CD133 分 子 的 脑 胶 质 瘤 细 胞 株 ， 为 CD133 分 子 的生 物 学 作 用 研 究 提 供 了 良 好 工 具 。I中 文 摘 要 CD133 分子对脑胶质瘤细胞生物学行为的作用研究第二部分 CD133 分 子 转 染 对 脑 胶 质 瘤细胞生物学行为的作用研究【 目 的 】 研 究 CD133 分 子 对 脑 胶 质 瘤 细 胞 的 增 殖 、 迁 移 、 细 胞 周 期 、 干 细 胞相 关 基 因 的 表 达 、 体 内 致 瘤 性 等 生 物 学 特 性 的 影 响 。【 方 法 】 以 第 一 部 分 构 建 的 U251-CD133 及 U251-mock 细 胞 株 为 研 究 模 型 ，利 用 细 胞 计 数 、 神 经 球 形 成 实 验 及 PI 染 色 法 检 测 CD133 分 子 对 脑 胶 质 瘤 细 胞 在 体外 增 殖 、 神 经 球 形 成 能 力 及 细 胞 周 期 的 影 响 ； Real Time PCR 检 测 CD133 基 因 转 染细胞株干细胞相关基因的表达；裸鼠皮下成瘤法检测 CD133 分子对脑胶质瘤细胞的体内致瘤性的影响。【 结 果 】 (1) 在 有 血 清 培 养 条 件 下 ， 人 CD133 分 子 对 脑 胶 质 瘤 细 胞 株 U251 的细 胞 增 殖 并 无 影 响 ； 但 在 无 血 清 神 经 干 细 胞 培 养 条 件 下 可 以 促 进 脑 胶 质 瘤 细 胞 神经球的形成；(2) 与 对 照 组 相 比 ， CD133 基 因 转 染 细 胞 株 S 期细胞比例明显增加；(3) CD133 分 子 促 进 脑 胶 质 瘤 细 胞 株 不 同 程 度 上 调 干 细 胞 相 关 基 因 的 表 达 ； (4)CD133 分子可明显增强脑胶质瘤细胞的体内致瘤性。【 结 论 】 初 步 研 究 表 明 CD133 分子促进脑胶质瘤细胞株进入 S 期 ； 促 进 脑 胶质 瘤 细 胞 上 调 干 细 胞 相 关 基 因 的 表 达 ， 增 强 脑 胶 质 瘤 细 胞 的 神 经 球 形 成 能 力 和 体内致瘤性。【 关 键 词 】 CD133；脑胶质瘤；干细胞相关基因；基因转染；致瘤性作 者 ： 马 晓 花指导老师：张学光IICD133 分子对脑胶质瘤细胞生物学行为的作用研究 英 文 摘 要The Impact of CD133 Overexpression on BiologicalCharacteristics of Human Glioma CellsAbstractRecent findings support the existence of cells with the properties of stem cells inseveral forms of human cancer, such as AML, breast cancer, brain cancer, colon cancer,melanoma. Cells of this type have the capacity for self-renewal, the potential to developinto multiple lineages, and the proliferative ability to drive continued expansion of thepopulation of malignant cells. Cancer stem cells contribute to tumor relapse andmetastasis. It may provide a critical therapeutic target.Glioma is the most common and highly aggressive primary brain tumor. Despitemultimodal treatment combining surgery, chemotherapy and radiation, the clinicaloutcome of patients remains dismal. Singh et al isolated glioma cancer stem cell usingCD133 as a special marker in 2003. Recent studies demonstrated CD133 was relative toglioma prognosis, angiogenesis and drug-resistant. However, the function of CD133molecule remains unclear.To investigate the role of CD133 in glioma cell, we constructed a CD133-overexpression cell line, and explore the effect on glioma cell proliferation, cell cycle,neurosphere formation, expression of ESC-like genes and tumorigenicity.Part I Construction of CD133-overexpression Glioma Cell LineObjective: To construct a transgenic glioma U251 cell line that stablyover-expressed human CD133 antigen.Methods: The full length human CD133 cDNA was sub-cloned into retroviralexpressing vector pEGZ-Term. To obtain viable virus, the recombinant plasmidpEGZ-Term-CD133 and its two additional viral vectors were co-transfected into 293Tpackaging cells with LipofectamineTM 2000. Then, U251 was infected by retrovirus-harboring supernatant of 293T, and selected with zeocine. The expression of CD133 onIII英 文 摘 要 CD133 分子对脑胶质瘤细胞生物学行为的作用研究transfected glioma cells was confirmed by flow cytometry and Real Time PCR.Results: The CD133 cDNA was sub-cloned into retroviral expressing vectorpEGZ- Term and a CD133-transfected glioma U251 cell line was constructedsuccessfully.Conclusion: We constructed a transfected glioma cell lines: U251-CD133.Part II The Impact of CD133 Overexpression on BiologicalCharacteristics of Human Glioma CellsObjective: To investigate the impact of CD133 overexpression on glioma celllines.Methods: By PI Dyeing , the cell cycle of CD133-infected U251 cell lines wasdetected. By cell counting and neurosphere formation analysis, the effect of CD133overexpression on proliferation and neurosphere formation of glioma cells in vitro wasdetermined. Then, Real Time PCR was performed to analyze expression of ESC-likegenes in CD133-infected U251 cells. And tumorigenicity was evaluate