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感受态细胞的制备及重组质粒的转化,experiments of molecular biology,重组DNA技术,重组DNA技术的基本工具,“分子运输车”,受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能允许含有外源DNA的载体分子通过的细胞,即感受态细胞(competent cell) 。,感受态细胞(competent cell),是将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。,转化是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。,转化(transformation),化学的方法(CaCl2法、热休克法):使用化学试剂(如CaCl2)制备的感受态细胞,通过热休克处理将载体DNA分子导入受体细胞。电转化法:使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。,转化的方法,转化原理(CaCl2法),将处于对数生长期的细菌置入0的CaCl2低渗溶液中,使细胞膨胀,同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构,使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域;此时加入DNA,Ca2+又与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物,并粘附在细菌细胞膜的外表面上;经短暂的42热脉冲处理后,细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,随之出现许多间隙,致使通透性增加,DNA分子便趁机进入细胞内。,转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体。,CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法,简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求。制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积 15-30的无菌甘油于-70保存(半年)。,影响转化效率的因素,实验原理,本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞,并用CaCl2处理使其处于感受态,然后与pMD19-T-X重组质粒共保温,实现转化。由于重组质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr ),可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pMD19-T-X重组质粒,则在含Amp的培养基上不能生长。能在含Amp培养基上生长的受体细胞(转化子)已导入了重组质粒。,抗Amp,宿主细菌,含Amp培养基,实验仪器、材料,1 超净工作台2 高速离心机3 恒温摇床4 恒温培养箱5 恒温水浴锅6 制冰机7 移液枪,实验材料、试剂,1大肠杆菌JM109菌株2重组质粒31.5mL 离心管,Tip头4试管、培养皿,1 LB液体培养基2含有Amp的LB平板培养基(终浓度为50gmL)3氨苄青霉素贮存液(浓度50mgmL)40.1mol/L CaCl2溶液,实 验 安 排,1,受体菌的培养,感受态细胞的制备,2,3,质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化,实验安排,一、受体菌的培养,从新活化的E.coli JM109平板上挑取一单菌落,接种于3ml LB液体培养中,37振荡培养12h左右,直至对数生长期。(已做)将该菌悬液以1:50转接于50ml LB液体培养基中,37 250rpm振荡扩大培养约1-2h,当OD600nm值为0.30.5时,取出置冰浴。,1、取1mL菌液于1只1.5mL离心管中,置冰浴5min,10000rpm离心 1min (每班需做对照管至少1管)(从这一步开始,所有操作均在冰上进行,速度尽量快而稳) ;2、弃上清,将离心管倒置于干净吸水纸上,每管加入0.5mL冰预冷 的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌,置冰浴10min;3、4000rpm离心10min,弃上清;4、每管加入50L冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌,冰上放置, 即为感受态细胞。,二、感受态细胞的制备,1、实验管加5L重组质粒DNA,对照管加5L灭菌水,轻轻 混匀,置冰浴20min;2、42水浴热应激90s(精确计时),迅速放回冰浴,冷却 5min后加入1mL LB液体培养基(不含Amp),37 250rpm振荡培养约1h;3、取50L菌液均匀涂布在LB琼脂平板上(含50g/mL Amp, 事先做好),37培养过夜(12-16h)后观察结果。,三、质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化,切记:玻璃棒经酒精灯烧过后稍微凉一下再用,不要过烫!,对照组:,以同体积的灭菌双蒸水代替重组质粒,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素(Amp)的LB琼脂平板上应没有菌落出现。,本次实验组预期结果:,感受态细胞长时间处在常温状态,会严重影响到其转化率,因此应尽量减少常温操作,动作要迅速(所有操作均应在冰上进行)。为减少对细胞的机械损伤,操作时动作一定要轻柔。菌液涂布操作时应避免反复来回涂布,过多的机械挤压涂布容易使感受态细菌细胞破裂,影响转化率。操作过程中注意防止杂菌和杂DNA的污染。,注意事项,1、影响CaCl2法转化率的因素有哪些?如何提 高转化率?2、如何利用抗性筛选出重组克隆?,思考题,
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