上 海 交 通 大 学硕 士 学 位 论 文OVA66 蛋 白 的 原 核 表 达 及 其 单 克 隆 抗 体 的 制 备 和 鉴 定姓 名 ： 陈 惠 娟申 请 学 位 级 别 ： 硕 士专 业 ： 免 疫 学指 导 教 师 ： 葛 海 良20080501 蛋 白 的 原 核 表 达 及 其 单 克 隆 抗 体 的 制 备 和 鉴 定 摘 要 OVA66 是 本 实 验 室 应 用 重 组 cDNA 表 达 文 库 血 清 学 分 析 （ SEREX）技 术 筛 选 人 卵 巢 癌 cDNA 文 库 得 到 的 一 种 新 的 肿 瘤 相 关 抗 原 。 前 期 实 验结 果 表 明 OVA66 呈 CT 抗 原 的 表 达 特 点 ， 主 要 表 达 于 某 些 肿 瘤 细 胞 及 睾丸 组 织 中 。 OVA66 基 因 高 表 达 可 促 进 肿 瘤 细 胞 的 增 殖 ， 有 利 于 细 胞 的 侵袭 和 转 移 。 本 研 究 着 重 于 两 方 面 工 作 ： OVA66 蛋 白 的 原 核 表 达 和 抗OVA66 单 克 隆 抗 体 的 制 备 和 鉴 定 。（ 1） 表 达 和 纯 化 OVA66 融 合 蛋 白 。 利 用 本 实 验 室 已 构 建 的 pcDNA3.1-OVA66 及 含 6 His 的 原 核 表 达 载 体 pET32b(+)， 构 建 重 组 质 粒pET32b-OVA66。 诱 导 大 肠 杆 菌 BL21(DE3)表 达 融 合 蛋 白 OVA66， 发 现融 合 蛋 白 主 要 以 包 涵 体 形 式 存 在 ， 将 包 涵 体 变 性 处 理 ， 获 得 可 溶 性 的 融合 蛋 白 ， 经 Ni-TED 亲 和 层 析 柱 纯 化 ， 然 后 用 透 析 方 法 将 融 合 蛋 白 复 性并 鉴 定 ， 融 合 蛋 白 纯 度 可 达 90 。（ 2） 制 备 小 鼠 抗 OVA66 单 克 隆 抗 体 并 分 析 其 生 物 学 特 性 。 以 纯 化 获 得 的OVA66 融 合 蛋 白 免 疫 BALB/c 小 鼠 ， 利 用 聚 乙 二 醇 将 免 疫 小 鼠 的 脾 细 胞 与SP2/0 细 胞 进 行 融 合 。 以 pET32b 空 载 体 表 达 蛋 白 为 对 照 检 测 杂 交 瘤 细 胞 培养 上 清 中 抗 OVA66 抗 体 的 分 泌 ， 筛 选 出 两 株 稳 定 分 泌 抗 OVA66 抗 体 的 细胞 5F4 和 4G9。 这 两 株 细 胞 分 泌 的 抗 体 亚 型 均 为 IgG1， 轻 链 为 ?型 。 5F4 抗体 的 亲 和 力 常 数 为 2.961010L/mol， 4G9 抗 体 的 亲 和 力 常 数 为 0.401010L/mol。 Western blot 结 果 证 实 这 两 株 杂 交 瘤 细 胞 分 泌 的 抗 体 针 对 OVA66蛋 白 的 不 同 表 位 。 应 用 细 胞 免 疫 荧 光 法 、 流 式 细 胞 术 、 Western blot 和 免疫 组 化 技 术 检 测 了 抗 体 的 特 性 。综上所述，本课题成功构建了重组载体 pET32b OVA66，纯化了OVA66 融 合 蛋 白 ， 制 备 了 两 株 小 鼠 抗 OVA66 单 克 隆 抗 体 杂 交 瘤 细 胞 ， 并分 析 抗 体 的 免 疫 生 物 学 特 性 ， 为 进 一 步 深 入 研 究 OVA66 的 生 物 学 功 能 和临 床 应 用 奠 定 了 基 础 。关 键 词 ： OVA66， 原 核 表 达 ， 蛋 白 纯 化 ， 单 克 隆 抗 体 ， ELISAPREPARITION AND IDENTIFICATION OFMONOCLONAL ANTIBODY AGAINSTPROKARYOTIC EXPRESSED OVA66 PROTEINABSTRACTOVA66, a new tumor-associated antigen, was obtained from a humanovarian cancer cDNA library by SEREX (serological analysis of recombinantcDNA expression library) in our lab. Our previous research workdemonstrated that OVA66 was mainly expressed in tumor cells, tumor andtestis tissue, suggesting that characteristics of OVA66 may be similar to CTantigens. The over-expression of OVA66 gene could accelerate cellproliferation and promote invasion and metastasis of tumor cells in vitro. Inthis study the OVA66 protein was expressed in prokaryotic cells and mouseanti-OVA66 monoclonal antibody was prepared and identified.Firstly, the gene encoding OVA66 in pcDNA3.1-OVA66 was insertedinto the prokaryotic expression vector pET32b(+) with 6His tag. Therecombinant plasmid pET32b-OVA66 was transfected into E.coli BL21(DE3)and then induced by IPTG. Most of the OVA66 fusion protein existed in theinclusion body and was solubilized with urea. The OVA66 fusion protein waspurified by Ni-TED column affinity chromatography and refolded viadialysis. The purity of the target protein could reach 90%.Secondly, female BALB/c mice were immunized with purified OVA66fusion protein and then the spleen cells of the immunized mouse and SP2/0cells were fused with PEG. The clones secreting anti-OVA66 antibodies werescreened with ELISA and two clones belonging to IgG1 subclass and kappatype were obtained and named as 5F4 and 4G9 respectively. The affinityconstant was 2.961010L/mol for 5F4 and 0.401010L/mol for 4G9. Thedifferent antigenic epitopes of OVA66 protein were determined by 5F4 and4G9 using Western blot. The biological characteristics of two monoclonalantibodies was identified by immunofluorescence, flow cytometry, Westernblot and immunohistochemistry.In conclusion, the recombinant vector pET32b-OVA66 was constructedand OVA66 fusion protein was purified. Two monoclonal antibodies againstOVA66 were obtained and characterized finally. These results may lay a solidfoundation for further studies on the biological characteristics of OVA66 andthe potential clinical application.KEY WORDS: OVA66, prokaryotic expression, protein purification,monoclonal antibody, ELISA缩略词 英文缩写 英文全称 中文全称 酶联免疫吸附试验 单克隆抗体 重组表达文库血清 学分析 异丙基 硫代半糖苷 次黄嘌呤氨基喋呤胸腺嘧啶 次黄嘌呤胸腺嘧啶核苷 聚乙二醇 杂氮鸟嘌呤 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 每分