华 中 科 技 大 学硕 士 学 位 论 文TLR4 在 人 绒 毛 膜 滋 养 细 胞 中 的 表 达 及 其 作 用 的 研 究姓 名 ： 韩 方申 请 学 位 级 别 ： 硕 士专 业 ： 妇 产 科 学指 导 教 师 ： 吴 超 英 ;王 泽 华20080501华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文中英文缩略词表bp base pair 碱 基 对cDNA complementary deoxyribonucleic acid 互 补 脱 氧 核 糖 核 酸DEPC diethyl pryocarbonate 焦 碳 酸 二 乙 酯DMEM Dulbeccos Modified Eagles Medium DMEM 培 养 基dNTP any of the four deoxyhucleotide 四 种 脱 氧 核 糖 三 磷triphosphates 酸 中 的 任 意 一 种EDTA ethylenediaminetetra-aceticaci 二 乙 烯 四 乙 酸 二 钠ELISA enzyme linked immunosorbent assay 酶 联 免 疫 吸 附 测 定F12 Hams F12 nutrient medium F12 培 养 基FBS fatal bovine serum 胎 牛 血 清FCM flow cytometry 流 式 细 胞 技 术LPS lipopolysaccharide 脂 多 糖OD optical density 吸 光 度PAMP pathogen-associated molecule pattern 病 原 相 关 分 子 模 式PBS Phosphate balanced solution 磷 酸 盐 缓 冲 液PCR polymerase chain reaction 聚 合 酶 链 反 应PRR pattern recognition receptor 模 式 识 别 受 体RT-PCR Reverse transcription polymerase 逆 转 录 聚 合 酶 链 技 术chain reactionTLR4 Toll like receptor 4 Toll 样 受 体 41独创性声明本 人 郑 重 声 明 ， 本 学 位 论 文 是 本 人 在 导 师 指 导 下 进 行 的 研 究 工 作 及 取 得 的 研 究 成果 的 总 结 。 尽 我 所 知 ， 除 文 中 已 经 标 明 引 用 的 内 容 外 ， 本 论 文 不 包 含 任 何 其 他 个 人 或集 体 已 经 发 表 或 撰 写 过 的 研 究 成 果 。 对 本 文 的 研 究 做 出 贡 献 的 个 人 和 集 体 ， 均 已 在 文中 以 明 确 方 式 标 明 。 本 人 完 全 意 识 到 本 人 将 承 担 本 声 明 引 起 的 一 切 法 律 后 果 。学 位 论 文 作 者 签 名 ：日 期 ： 年 月 日学位论文版权使用授权书本 学 位 论 文 作 者 完 全 了 解 学 校 有 关 保 留 、 使 用 学 位 论 文 的 规 定 ， 即 ： 学 校 有 权 保留 并 向 国 家 有 关 部 门 或 机 构 送 交 论 文 的 复 印 件 和 电 子 版 ， 允 许 论 文 被 查 阅 和 借 阅 。 本人 授 权 华 中 科 技 大 学 可 以 将 本 学 位 论 文 的 全 部 或 部 分 内 容 编 入 有 关 数 据 库 进 行 检 索 ，可 以 采 用 影 印 、 缩 印 或 扫 描 等 复 制 手 段 保 存 和 汇 编 本 学 位 论 文 。保 密 ， 在 _年 解 密 后 适 用 本 授 权 书 。本 论 文 属 于不 保 密 。（ 请 在 以 上 方 框 内 打 “ ” ）学 位 论 文 作 者 签 名 ： 指 导 教 师 签 名 ：日 期 ： 年 月 日 日 期 ： 年 月 日华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文TLR4 在人绒毛膜滋养细胞中的表达及其作用的研究研 究 生 ： 韩 方指 导 老 师 ： 吴 超 英 副 教 授王 泽 华 教 授中文摘要目 的 ： 研 究 TLR4 mRNA 在 原 代 培 养 的 绒 毛 膜 滋 养 细 胞 中 的 表 达 ， 及 LPS 刺 激 时 TLR4mRNA 表达的变化，及 TLR4 在 LPS 刺激引起的细胞凋亡， TNF- 分 泌 释 放中 的 作 用 。方 法 ： 分 离 培 养 人 绒 毛 膜 滋 养 细 胞 ， 用 一 定 浓 度 的 LPS 作 用 于 原 代 培 养 的 人 绒 毛 膜 滋养 细 胞 ， 在 作 用 的 不 同 时 间 （0h, 2h， 12h， 24h） ，用 RT PCR 法 检 测 TLR4mRNA的 表 达 ； 流 式 细 胞 技 术 检 测 细 胞 凋 亡 率 ； ELISA 法 检 测 细 胞 培 养 液 中 TNF-的 浓 度 。结 果 ： 原 代 培 养 的 绒 毛 膜 滋 养 细 胞 表 达 TLR4， LPS 孵育刺激可使其表达明显增强；LPS 刺激时细胞凋亡率明显增加，而预先用 TLR4 抗体封闭 TLR4 时则无此表现 ； LPS 刺激后，细胞分泌的 TNF- 也 明 显 增 加 ， 且 可 以 被 中 和 性 TLR4 抗体 所 阻 断 。结 论 ： TLR4 在 人 绒 毛 膜 滋 养 细 胞 中 有 表 达 ， 且 可 能 在 LPS 引起的绒毛膜滋养细胞凋亡 ， 及 TNF- 的 分 泌 释 放 中 起 重 要 作 用 。关 键 词 ： TLR4； LPS； 滋 养 细 胞 ； 凋 亡 ； TNF-2华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文Expression and roles of toll like receptor 4 in culturedhuman chorionic trophocyte cellAbstractObjective The aim of the study was to investigate the expression of TLR4 mRNA inprimary chorionic trophocyte cell with or without the stimulation of LPS, theeffect of TLR4 on the cell apoptosis and the secretion of TNF- induced byLPS.Methods Trophoblasts were isolated from chorionic membrane and cultured in vitro.Cultured chorionic trophocyte cells were treated with LPS for differenttime(0h, 2h, 12h， 24h). The expression of TLR4 was detected by reversetranscription polymerase chain reaction (RT-PCR), the apoptosis of trophocytecell was measured by Flow cytometry (FCM) and the secretion of TNF- wasmeasured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Results TLR4 mRNA was expressed in Primary chorionic trophoblast cells and theexpression of TLR4 mRNA increased when cells treated whith LPS. LPScould induce chorionic trophocyte apoptosis, and LPS-induced apoptosiscould be blocked by pretreating with TLR4Ab. LPS could increse thesecretion of TNF- , and LPS-induced secretion of TNF- could also beblocked by TLR4Ab.Conclusion ultured chorionic trophocytes express TLR4 mRNA. TLR4 may play animportant role in LPS-induced apoptosis and secretion of TNF- .Key words TLR4, LPS, trophocyte, apoptosis, TNF-3华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文前 言Toll 蛋 白 是 高 度 保 守 的 I 型 穿 膜 蛋 白 ， 在 果 蝇 的 胚 胎 发 育 和 先 天 性 免 疫 中 发 挥 关键 作 用 。 存 在 于 哺 乳 动 物 与 Toll 蛋 白 同 源 的 分 子 被 称 为 Toll 样 受 体 ， 是 一 类 介 导 先 天性 免 疫 的 跨 膜 信 号 传 递 受 体 家 族 , 在 细 胞 活 化 信 号 的 转 导 中 起 重 要 作 用 , 是联系先天性 免 疫 与 获 得 性 免 疫 的 桥 梁 。 自 1997 年 Medzhitov 等 1发 现 第 一 个 人 Toll 样 受 体 , 迄今 为 止 , 已 在 哺 乳 类 动 物 中 发 现 了 12 种 TLR 分 子 。TLR4 是 研 究 最 早 、 作 用 也 最 明 确 的 TLR 分 子 ， 是 LPS 跨 膜 信 号 的 特 异 性 兴 奋 性受 体 ， 在 介 导 机 体 针 对 革 兰 氏 阴 性 细 菌 的 先 天 性 免 疫 反 应 的 中 发 挥 重 要 作 用 。 ONeillS， Vogel SN 等 2, 3研 究 结 果 显 示 ， 将 TLR4 基 因 转 入 不 表 达 TLR4 的 细 胞 内 ， 可 使 不具 有 LPS 反 应 性 的 细 胞 具 有 一 定 的 LPS 反 应 性 。 相 反 ， 将 LPS 反 应 性 细 胞 内 的 TLR4基 因 进 行 突 变 或 缺 失 ， 细 胞 则 出 现 LPS 低 反 应 性 或 耐 受 。 采 用 热 灭 活 的 大 肠 埃 希 菌 行C3H/ HeJ 孕 鼠 （ TLR4 基 因 突 变 ） 宫 内 注 射 ， 发 现 C3H/ HeJ 孕 鼠 对 LPS 产生耐受 4。妊 娠 期 宫 内 感 染 给 孕 妇 和 胎 儿 都 带 来 极 大 的 损 害 和 危 险 ， 是 早 产 等 妊 娠 并 发 症 的重 要 原 因 。 据 统 计 ， 宫 内 感 染 占 早 产 发 病 原 因 的 30%5， 微 生 物 可 能 通 过 阴 道 和 宫 颈上行感染, 或者经过胎盘的血源性播散，或从腹腔到输卵管的逆行性种植，或经过羊膜 腔 穿 刺 、 绒 毛 活 检 、 胎 儿 脐 血 管 穿 刺 等 宫 腔 操 作 等 途 径 侵 入 子 宫 ， 引 发 宫 内 感 染 。宫 内 感 染 的 病 原 体 最 常 见 的 是 革 兰 氏 阴 性 细 菌 。 LPS 是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分 ， 是 决 定 革 兰 氏 阴 性