分 类 号 ： R614.1 密 级：一 般U D C ： 616-005 编 号：2010212228广州医科大学硕 士 研 究 生 学 位 论 文乌司他丁对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织 AQP4 表达的影响研 究 生 ： 陈 海 铭导 师 ： 黄 焕 森 主 任 医 师申请学位级别：医学硕士 年 级 ：二零一零级学科专业：麻醉学 研 究 方 向 ： 麻 醉 与 组 织 器 官 保 护论文提交日期： 2013 年 5 月 论文答辩日期： 2013 年 5 月学位类型：临床医学专业学位 学 位 授 予 单 位 ： 广 州 医 学 院答辩委员会主席：评 议 人 ：2013 年 5 月广州医科大学硕士学位论文乌司他丁对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织 AQP4 表达的影响Effect of Ulinastatin on expression of AQP4 in rats withcerebral ischemia-reperfusion injury专 业 方 向 ： 麻 醉 学研 究 方 向 ： 麻 醉 与 组 织 器 官 保 护学 位 申 请 人 ： 陈 海 铭导 师 ： 黄 焕 森 主 任 医 师广 州 医 学 院 广 州2013 年 5 月乌司他丁对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织 AQP4 表达的影响 广州医科大学硕士学位论文目 录英 文 缩 略 词 表 . 1中 文 摘 要 .3英 文 摘 要 .6前 言 .9材 料 和 方 法 . 12结 果 .17讨 论 .25结 论 .29参 考 文 献 一 . 30综 述 .34参 考 文 献 二 . 39致 谢 .43学 位 论 文 原 创 性 声 明 .44学 位 论 文 知 识 产 权 权 属 声 明 .44关 于 学 位 论 文 使 用 授 权 说 明 .45乌司他丁对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织 AQP4 表达的影响 广州医科大学硕士学位论文英文缩略词表英 文 缩 写 英 文 全 称 中 文 全 称AQPs Aquaporins 水 通 道 蛋 白AQP4 AquAporin-4 水 通 道 蛋 白 4CVD Cerebral Vascular Diseases 脑 血 管 疾 病CIRI Cerebral Ischemic Reperfusion Injury 脑缺血再灌注损伤MCAO Middle Cerebral Artery Occlusion 大 脑 中 动 脉 闭 塞NDS Neurological Deficit Score 神 经 功 能 缺 陷 评 分BBB Blood Brain Barrier 血 脑 屏 障CCA Common Carotid Artery 颈 总 动 脉ICA Internal Carotid Artery 颈 内 动 脉ECA External Carotid Artery 颈 外 动 脉PBS Phosphate Buffer Solution 磷 酸 盐 缓 冲 液IHC Immunohistochemistry 免 疫 组 织 化 学WB Western Blotting 免 疫 印 迹S Sham-operation 假 手 术IR Ischemia Reperfusion 缺 血 再 灌 注U Ulinastatin 乌 司 他 丁TTC Tetrazolium Chloride 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑OD Optical Density 光 密 度PMSF Phenylmethyl Sulfonylfluoride 苯 甲 基 磺 酰 氟 化 物CNS Central Nervous System 中 枢 神 经 系 统1乌司他丁对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织 AQP4 表达的影响 广州医科大学硕士学位论文AVP Vasopressin 抗 利 尿 激 素PKA Protein Kinase A 蛋 白 激 酶 APKC Protein Kinase C 蛋 白 激 酶 CCaMK Calcium Dependent Protein Kinase 钙 依 赖 蛋 白 激 酶 CK Casein Kinase 酪 蛋 白 激 酶 NKCC1 Na+K+Cl- Cotransporters 1 Na+-K+-2Cl-协 同 转 运 蛋 白 12乌司他丁对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织 AQP4 表达的影响 广州医科大学硕士学位论文乌司他丁对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织 AQP4表达的影响专 业 ： 麻 醉 学研 究 生 ： 陈 海 铭导 师 ： 黄 焕 森 主 任 医 师广 州 医 学 院 第 二 附 属 医 院 麻 醉 科摘 要研 究 背 景 和 目 的脑 血 管 疾 病 （ Cerebral vascular diseases, CVD） 是 严 重 危 害 人 类 生 命 的 疾 病 之一，而其中脑缺血再灌注损伤是最常见的脑血管疾病。脑缺血再灌注损伤（ Cerebral Ischemia Reperfusion Injury, CIRI） 是指脑缺血一定时间再恢复血液供应后 ， 其 功 能 不 但 未 能 恢 复 ， 却 出 现 脑 功 能 损 害 加重的现象。缺血再灌注损伤是一个复 杂 的 病 理 过 程 ， 阻 断 大脑动脉血流后会导致神经细 胞 死 亡 ， 而 血 液 恢复后的再灌注 可 引 起 炎 症 反 应 ， 氧 自 由 基 增 加 ， 细 胞 凋 亡 等一系 列 病 理 改 变 ， 除 脑组织受到进一 步 损 伤 外 ， 使 血 管 通 透 性 改 变 和 血 脑 屏 障 的 破 坏 ， 进 而 导 致 脑 水 肿 的 出 现 。 目前，脑水肿形成的分子机制尚未十分清楚。水通道蛋白是一类水选择性膜通道，它主要调节人体内组织和细胞之间的水分转 运 。 至 今 为 止 ， 一 共 发 现 有 13 种水通道蛋白。1 994 年 ， Hasegawa 在 实 质 组 织 和保存液体的室隔之间找到水通道蛋白（A QP4） ， 成 功 在 小 鼠 肺 组 织 中 克 隆 出 AQP4。AQP4 分布于全身各处，其中以脑部表达最为丰富，主要分布于胶质细胞膜、室管膜和 下 丘 脑 等 处 ， 通 过 对 脑 脊 液 的 分 泌 和 重 吸 收 调 节 脑 组 织 内 水 平 衡 。 有研究证实，3乌司他丁对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织 AQP4 表达的影响 广州医科大学硕士学位论文在 脑 缺 血 后 脑 梗 死 灶 周 围 的 星 形 胶 质 细 胞 及 病 灶 附 近 的 软 脑 膜 下 和 室 管膜下、梗死侧 皮 质 均 有 AQP4 的表达，且与脑水肿的程度呈正相关。有研究 AQP4 基 因 敲 除 小 鼠中 进 行 脑 水 中 毒 实 验 观 察 发 现 , AQP4 基 因 敲 除 小 鼠 的 脑 水 肿 减 轻 ， 存 活 率 提 高 ， 脑组 织 中 的 水 积 累 也 明 显 减 少 。 另 有 研 究 通 过 对 AQP4 基 因 敲 除 小 鼠 与 野 生 型 进 行 皮质 冻 伤 模 型 实 验 和 脑 肿 瘤 炎 症 实 验 ， 发 现 AQP4 基 因 敲 除 小 鼠 的 脑 组 织 水 肿 的 消 除时间比野生小鼠慢，以上研究表明 AQP4 有清除脑水肿的作用。因此认为 AQP4 在 脑水肿形成与消除中均发挥作用。乌 司 他 丁 是 从 健 康 男 性 尿 液 中 提 取 出 来 的 糖 蛋 白 ， 其 分 子 量 为 6700Da。 由 于 乌司 他 丁 具 有 抗 蛋 白 酶 和 抗 炎 症 反 应 的 作 用 ， 所 以 临 床 中 已 经 广 泛 用于治疗一些急性炎 症 疾 病 ， 例 如 胰 腺 炎 、 弥 漫 性 血 管 内 凝 血 和 休 克 等 一 些 疾 病 。 最 近 一 些 研 究 发现 ， 乌 司 他 丁 通 过 阻 断 炎 症 因 子 的 级 联 反 应 ， 抑 制 白 细 胞 的 过 度 激 活 和增强自由基的 清 除 能 力 ， 在 脑 缺 血 再 灌 注 损 伤 中 起 着 脑保护作用。目前，乌司他丁对脑缺血再灌 注 损 伤 后 脑 组 织 中 AQP4 是 否 存 在 调 节 作 用 尚 未 有 研 究 证 实 。本 研 究 建 立 大 鼠 右 侧 大 脑 中 动 脉 栓 塞 模 型 （ MCAO 模 型 ） ， 观 察 乌 司 他 丁 对 局 灶性 脑 缺 血 再 灌 注 后 脑 组 织 梗 死 体 积 、 脑 水 肿 情 况 及 AQP4 表 达 的 影 响 ， 探 讨 乌 司 他丁 在 脑 缺 血 再 灌 注 损 伤 的 作 用 及 可 能 机 制 ， 为 脑 缺 血 再 灌 注 损 伤 后 脑 水肿的治疗提供 新 的 方 法 和 理 论 依 据 。方 法成 年 雄 性 SD 大 鼠 160 只 ， 体 重 为 230 280g， SPF 级，随机分为假手术组( S组，n =40)、 缺 血 再 灌 注 组 (IR 组 ， n=60)和 乌 司 他 丁 治 疗 组 (U 组 ， n=60)。 采 用 线栓 法 建 立 大 鼠 右 侧 大 脑 中 动 脉 栓 塞 局 灶 性 大 脑 缺 血 再 灌 注 模 型 （ MCAO） ， 缺 血 2h再 恢 复 灌 注 。 U 组于缺血再灌注后即给予乌司他丁 10 万 u/kg 尾 静 脉 注 射 ， S 组 和IR 组 于 缺 血 再 灌 注 后 给 予 等 容 量 生 理 盐 水 。 在 缺 血 再 灌 注 后 6h、 24h、 48h，观察大 鼠 行 为 学 改 变 ， 并 予 神 经 功 能 缺 陷 评 分 ； TTC 染 色 后 ， 图 像 分 析 测 定 梗 死 体 积 ；用 干 湿 重 法 测 定 脑 组 织 含 水 量 ； 免 疫 组 化 、 免 疫 印 迹 测 定 AQP4 的 表 达 。4乌司他丁对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织 AQP4 表达的影响 广州医科大学硕士学位论文结 果1、 神 经 功 能 缺 陷 评 分 在 缺 血 再 灌 注 后 6h、 24h、 48h， IR 组 和 U 组 大 鼠 的 神经 功 能 缺 陷 （ NDS） 评 分 均 高 于