学 校 代 码 10530 学 号 201015081420分 类 号 Q815 密 级硕 士 学 位 论 文以 莲 子 壳 为 原 料 固 态 发 酵 生 产 饲用 复 合 酶学 位 申 请 人 吴 锋指 导 教 师 陶能国 副教授学 院 名 称 化 工 学 院学 科 专 业 化 学 工 程研 究 方 向 生物资源综合利用二一三年六月一日Production of multienzyme preparationsunder solid-state fermentation (SSF) onLotus Seed ShellCandidate Wu FengSupervisor Nengguo Tao Vice ProfessorCollege Chemical Engineering CollegeProgram Biochemical EngineeringSpecialization Chemical EngineeringDegree Master of EngineeringUn iversit y Xiangtan UniversityDat e June, 20132湘潭大学学位论文原创性声明本 人 郑 重 声 明 ： 所 呈 交 的 论 文 是 本 人 在 导 师 的 指 导 下 独 立 进 行 研 究 所取 得 的 研 究 成 果 。 除 了 文 中 特 别 加 以 标 注 引 用 的 内 容 外 ， 本 论 文 不 包 含 任何 其 他 个 人 或 集 体 已 经 发 表 或 撰 写 的 成 果 作 品 。 对 本 文 的 研 究 做 出 重 要 贡献 的 个 人 和 集 体 ， 均 已 在 文 中 以 明 确 方 式 标 明 。 本 人 完 全 意 识 到 本 声 明 的法 律 后 果 由 本 人 承 担 。作 者 签 名 ： 日 期 ： 年 月 日学位论文版权使用授权书本 学 位 论 文 作 者 完 全 了 解 学 校 有 关 保 留 、 使 用 学 位 论 文 的 规 定 ， 同 意学 校 保 留 并 向 国 家 有 关 部 门 或 机 构 送 交 论 文 的 复 印 件 和 电 子 版 ， 允 许 论 文被 查 阅 和 借 阅 。 本 人 授 权 湘 潭 大 学 可 以 将 本 学 位 论 文 的 全 部 或 部 分 内 容 编入 有 关 数 据 库 进 行 检 索 ， 可 以 采 用 影 印 、 缩 印 或 扫 描 等 复 制 手 段 保 存 和 汇编 本 学 位 论 文 。涉 密 论 文 按 学 校 规 定 处 理 。作 者 签 名 ： 日 期 ： 年 月 日导 师 签 名 ： 日 期 ： 年 月 日摘 要莲 子 壳 中 富 含 纤 维 素 以 及 氮 、 磷 等 矿 物 元 素 ， 适 宜 作 为 微 生 物 的 生 长 基 质 ，而 纤 维 素 酶 、 蔗 糖 酶 、 果 胶 酶 以 及 木 聚 糖 酶 等 酶 制 剂 在 饲 料 工 业 中 发 挥 着 越 来 越重 要 的 作 用 。 本 课 题 对 以 莲 子 壳 为 主 要 原 料 生 产 饲 用 复 合 酶 进 行 了 研 究 ， 筛 选 出了 产 酶 较 高 的 优 势 菌 株 ； 对 培 养 的 工 艺 条 件 进 行 了 优 化 并 对 复 合 酶 的 热 稳 定 性 进行 了 研 究 。 主 要 研 究 结 果 如 下 ：1 、 通 过 对 草 酸 青 霉 （ Penicillium oxalicum ） ， 多 变 根 毛 霉 （ RhizomucorVariabilis） ，爪哇正青霉（ Eupenicillium javanicum）棘孢曲霉（ Aspergillus aculeatus）和 黑 曲 霉 （A spergillus niger）五 株 菌 种 的 综 合 产 酶 能 力 进 行 分 析 比 较 ， 确 定 了 以棘孢曲霉和多变根毛霉作为生产饲用复合酶的菌株。2、通过单因素试验确立了棘孢曲霉固态发酵产复合酶的培养温度、时间、水 料 比 以 及 初 始 pH 为四个关键因子，其他非关键因子为：莲壳/ 豆 粕 为 7:3， 碳源 为 1g 稻 草 粉 ， 氮 源 为 0.1g 硫 酸 铵 ， 无 机 盐 为 0.1g 磷 酸 氢 二 钠 和 5%的 接 种量 (106107 个 /mL)。用 响 应 曲 面 法 来 优 化 四 个 关 键 因 素 ， 得 到 棘 孢 曲 霉 固 态 发 酵 产 饲 用 复 合 酶 的最 佳 工 艺 条 件 为 ： 发 酵 温 度 为 28.22 ， 发 酵 时 间 为 81.40h， 水料比为 1:1.08 ，pH 为 5.12， 此 时 CMC 酶 、 -葡 萄 糖 苷 酶 、 蔗 糖 酶 、 果 胶 酶 、 果 胶 裂 解 酶 和 木 聚糖酶的活性分别为 14.58U/g、 51.55 U /g、 133.12 U /g、 140.80 U /g、 130.70U/g、63.17U/g， 通 过 对 三 次 平 行 试 验 所 得 的 平 均 值 与 模 型 预 测 值 的 比 较 ， 验 证 各 个 酶活的相对误差分别为 4.22%、 0.37%、 3.74%、 11.35%、 6.10%、 3.17%， 符 合 误差 范 围 。通 过 分 析 80 、 40 、 25与 4 四 个 温 度 下 的 复 合 酶 活 性 随 时 间 的 变 化数据结果表明 80 条 件 下 保 存 4h 内酶活的损失小于 50%； 40 条 件 下 保 存 10d内 酶 活 的 损 失 小 于 50%； 25 条 件 下 保 存 20d 内 酶 活 的 损 失 小 于 50%； 4条件下 保 存 30d 内果胶裂解酶活活性的损失小于 50%， 其 他 酶 活 损 失 小 于 80%。3、 通 过 单 因 素 试 验 确 立 了 多 变 根 毛 霉 固 态 发 酵 产 复 合 酶 的 最 佳 工 艺 条 件 为 ：培 养 温 度 28 、 培 养 时 间 为 64h、 培 养 基 的 水 料 比 为 1:1.5、 培 养 基 初 始 pH 为4.2、 莲 壳 /豆 粕 为 9:1、 碳 源 为 1g 稻 草 粉 、 氮 源 为 0.1g 硫 酸 铵 、 无 机 盐 为 0.1g磷 酸 氢 二 钠 和 3% 的 接 种 量 , 此 时 CMC 酶 、 -葡 萄 糖 苷 酶 、 蔗 糖 酶 、 果 胶 酶 、果胶裂解酶和木聚糖酶的活性分别为 10.43U/g、 14.02U/g、 22.95U/g、 68.23U/g、62.35U/g 、 48.12 U/g。关键词：莲子壳；响应曲面法；固态发酵；复合酶IAbstractThe Lotus Seed Shell contain abundant fiber and minerals such as nitrogen andphosphorus elements, so they can be used as the suitable substrate to support growthof microorganisms. Enzymes,such as cellulase,sucrose,pectinase and xylanase areplaying an increasingly important role in the feed industry. The research described inthis paper was aimed at studying the utilization of Lotus Seed Shell as substrates forcompound enzyme production ,and predominant strain was obtained finally which canproduce higher enzyme. The solid-state fermentation (SSF) process condition wasoptimized and the thermal stability of compound enzyme was studied.The result ofthis study was reported as follow:1. Through analysis and comparison the productivity of multienzyme of Penicill-ium oxalicum,Rhizomucor Variabilis,Eupenicillium javanicum,Aspergillus aculeatusand Aspergillus niger, and firmly establish Rhizomucor Variabilis and Aspergillusaculeatus as strain of the bacteria fermentation to produce feed enzyme preparation.2. Through single factor experiment established different temperature, differenttime, different ration of water and material , different initial pH as the critical factorsof solid-state fermentation to produce compound enzyme.Other non-critical factorsfor producing of above multiple enzymes was: the mass ratio of lotus seed shell andsoybean meal is 7:3, 1 g rice straw powder as carbon source, 0.1 g (NH4)2SO4 asnitrogen source,0.1 g Na2HPO4 as inorganic salt and 5% of the quantity(106107 permilliliter).Using response surface methodology(RSM) to optimize the four critical factors,The optimum reaction conditions of Aspergillus aculeatus solid-state fermentationwas obtained as follows: incubation temperature 28.22 C, incubation time 81.40 h,the ratio of material to water is 1:1.08, the initial pH is 5.12. At this point, the enzymeactivities of CMC, -glycosidase, invertase, pectinase, pectate lyase and xylanasecould achieve 14.58U/g, 51.55U/g, 133.12U/g, 140.80U/g, 130.70U/g, 63.17U/g,respectively. Comparing the average results between