密 级 ： 学 校 代 码 ： 10075分 类 号 ： Q93 学 号 ： 20101432理 学 硕 士 学 位 论 文利用基因组重排技术选育土霉素高产菌株学位申请人： 张大伟指 导 教 师 ： 吕志堂 教授学 位 类 别 ： 理学硕士学 科 专 业 ： 微生物与生化药学授 予 单 位 ： 河北大学答 辩 日 期 ： 二一三年六月Classified Index: CODE: 10075U.D.C.: NO: 20101432A Dissertation for the Degree of M.ScienceScreening of High OxytetracyclineYielding Strains Using GenomeShuffling TechniqueCandidate： Zhang DaweiSupervisor： Prof. Lu ZhitangSpecialty： Microbial & Biochemical PharmacyAcademic Degree Applied for： Master of ScienceUniversity： Hebei UniversityDate of Oral Examination： June, 2013摘 要摘 要土 霉 素 (Oxytetracycline, OTC)是 由 龟 裂 链 霉 菌 产 生 的 一 种 碱 性 广 谱 抗 生 素 ， 作 为 强力 霉 素 的 原 料 药 在 医 药 生 产 方 面 有 广 阔 的 市 场 ， 作 为 兽 用 抗 生 素 和 饲 料 添 加 剂 在 畜 牧 业生 产 中 有 巨 大 的 经 济 效 益 。 本 论 文 在 对 龟 裂 链 霉 菌 (Streptomyces rimosus)菌 株 JH 最 佳 原生 质 体 制 备 和 再 生 条 件 的 研 究 基 础 上 ， 运 用 原 生 质 诱 变 技 术 筛 选 得 到 了 3 株 土 霉 素 产 量较 高 和 2 株 产 孢 能 力 较 强 的 菌 株 ， 将 其 作 为 基 因 组 重 排 的 亲 本 ； 通 过 最 佳 产 孢 培 养 基 的筛选和基因组重排技术选育土霉素高产菌株。本 文 对 龟 裂 链 霉 菌 JH 菌 株 原 生 质 体 制 备 进 行 研 究 ， 实 验 结 果 表 明 JH 菌 株 原 生 质 体制 备 的 最 佳 条 件 为 ： 250 mL 三 角 瓶 中 装 有 50 mL 含 2 %甘 氨 酸 的 YEME 培 养 基 ， 5 mL107 个 /mL 孢子悬液接种，2 8 、 200 r/min 培养 14 h； 4000 r/min 收 集 菌 丝 体 ， 用 10.3 %蔗 糖 溶 液 清 洗 3 次；用含 2 mg/mL 溶 菌 酶 的 P 溶 液 重 悬 菌 丝 体 ， 37 下脱壁 90 min，形 成 原 生 质 体 数 达 5.5107 个 /mL，原生质体再生率 27.0 %。通 过 对 龟 裂 链 霉 菌 JH 原 生 质 体 进 行 亚 硝 基 胍 (Nitrosoguanidine， NTG)诱 变 得 到 3株高产但产孢能力差的高产突变株 3016、 4016 和 4018， 以 及 2 株产孢能力较强的突变株 1017 和 2016。 对 这 3 株 高 产 突 变 株 在 燕 麦 培 养 基 、 麦 麸 培 养 基 、 链 霉 菌 产 孢 培 养 基 、高 氏 培 养 基 、 淀 粉 培 养 基 和 种 子 固 体 培 养 基 的 产 孢 情 况 进 行 对 比 ， 筛 选 出 种 子 固 体 培 养基 是 最 佳 产 孢 培 养 基 。30 W 紫 外 灯 在 30 cm 处 照 射 35 min 或 70 水 浴 处 理 60 min 均 可 使 龟 裂 链 霉 菌 原生 质 体 有 效 灭 活 。 通 过 对 促 融 剂 PEG4000 浓 度 和 融 合 时 间 的 优 化 ， 得 出 龟 裂 链 霉 菌 最佳原生质体融合条件为：用 40 % PEG4000 对 原 生 质 体 处 理 10 min， 融 合 率 可 达 22 %，并 达 到 稳 定 。 在 此 基 础 上 ， 以 NTG 诱 变 筛 选 得 到 的 3 株 高 产 突 变 株 、 2 株 产 孢 能 力 较强突变株和生长周期最短的出发菌 JH 作为亲本，进行基因组重排育种。通过六轮基因组重排处理， 以优化的 链霉素抗性平板进行融 合子的快速筛选、以琼 脂块- 酶 标仪法初筛 、 紫 外 分 光 光 度 法 复 筛 ， 筛 选 得 到 1 株 高 产 菌 F6173， 其 发 酵 效 价 11042 127.2 u/mL，比 出 发 菌 株 JH 提 高 了 10.38 倍 。 传 代 实 验 表 明 菌 株 稳 定 性 好 。关 键 词 土 霉 素 龟 裂 链 霉 菌 原 生 质 体 诱 变 基 因 组 重 排i河北大学理学硕士学位论文AbstractThe broad-spectrum antibiotics Oxytetracycline(OTC) is produced by Streptomycesrimosus. OTC, as bulk drug of doxycycline, has a broad market prospect in pharmaceuticalproduction, and has huge economic benefits as a veterinary antibiotics and feed additives inlivestock production. In this thesis, 3 mutant strains with higher OTC yield and 2 mutantswith high spore forming ability were obtained based on protoplast preparation andregeneration conditions research followed by nitrosoguanidine mutagenesis of the originalOTC producing strain Streptomyces rimosus JH. After the optimal spore forming medium wasselected, these mutants were used as the parental strains for genomic shuffling, and highOTC-yielding strains were got.The protoplast preparation conditions of Streptomyces rimosus JH were optimized. Theresult showed that optimal conditions for protoplast preparation of strain JH were as following:cultured in 250 mL Erlenmeyer flask with 50 mL YEME containing 2 % glycine at 28 ,and shaking at 200 r/min for 14h with inoculation of 5 mL 107/mL of spore. Then myceliawere collected by centrifuged at 4000 r/min and washed three times using 10.3 % sucrosesolution. After the mycelia were resuspended using P buffer containing 2 mg/mL lysozyme at37 for 90 min to remove the cell wall, 5.5107/mL protoplasts formed and the regenerationrate reached 27.0 %.Protoplast of Streptomyces rimosus JH was mutated by nitrosoguanidine and 3 strains,3016, 4016and4018， with higher OTC yields but lower spore forming ability were screened,as well as 2 spore-fast-forming strains 1017 and 2016. The 3 strains were cultured on oatsmeal medium, wheat bran medium, Streptomycetes sporulation medium, Gauses medium,starch medium and seed solid medium, and the comparison result clearly showed that seedsolid medium is the best sporulation medium.Irradiation for 30min by 15W UV lamp from 30cm or heat treated for 60min at 70 cankill the protoplast in all. The concentration of PEG 4000 and protoplast fusion time wereoptimized. The research showed that the best result occurred under the condition of fused for10 min at 40% PEG 4000， the fusion rate reached 22 % and the system were stable. On thebasis above, 3 OTC high yielding strains, 2 spore-fast-forming strains obtained inmutagenesis and the original strain JH were used as parent strains for genome shuffling.iiAbstractThrough six rounds of protoplast fusions, a very high OTC-producing fusion F6173 wasscreened by using optimized 2.5g/mL streptomycin resistance plate screening, agarblock-microplate reader method and UV photometric method. The OTC flask fermentationtiter was 1098557 u/mL within 5 generations and 10.32 times more than the original strainStreptomyces rimosus JH. Subculture experiment indicated that F