安 徽 医 科 大 学硕 士 学 位 论 文呼 吸 道 合 胞 病 毒 治 疗 性 单 克 隆 抗 体 的 制 备 及 其 免 疫 保 护 作 用 研究姓 名 ： 王 小 波申 请 学 位 级 别 ： 硕 士专 业 ： 免 疫 学指 导 教 师 ： 何 金 生20091001安 徽 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文呼 吸 道 合 胞 病 毒 治 疗 性 单 克 隆 抗 体 的 制 备 及 其 免 疫 保护 作 用 研 究中 文 摘 要目 的 ： 人 呼 吸 道 合 胞 病 毒 （ Human Respiratory Syncytial Virus， RSV） 广 泛 分 布 于世 界 各 地 ， 是 导 致 婴 幼 儿 严 重 下 呼 吸 道 感 染 最 重 要 的 病 毒 病 原 。 病 毒 感 染 机 体 后的 免 疫 保 护 机 制 尚 未 明 确 ， 也 无 特 异 性 防 治 方 法 。本研究尝试利用杂交瘤技术，制 备 具 有 中 和 活 性 的 单 克 隆 抗 体 ， 并 开 展 RSV 免 疫 治 疗 研 究 ， 以 期 为 研 制 具 有 自主 知 识 产 权 的 RSV 治 疗 性 单 克 隆 抗 体 奠 定 基 础 。方 法 ： 用 RSV 活 病 毒 通 过 滴 鼻 免 疫 小 鼠 ， 取 免 疫 小 鼠 的 脾 脏 与 骨 髓 瘤 细 胞 进 行 细胞 融 合 ， 通 过 有 限 稀 释 法 亚 克 隆 和 间 接 ELISA 进 行 筛 选 ， 获 得 稳 定 分 泌 抗 RSV 单克 隆 抗 体 （ Monoclonal antibody, McAb） 的 杂 交 瘤 细 胞 株 。 将 杂 交 瘤 细 胞 注 入 小 鼠腹 腔 诱 生 腹 水 ， 利 用 G 蛋 白 亲 和 层 析 法 从 腹 水 中 纯 化 抗 体 。 使 用 SDS-PAGE 检 测纯 化 后 抗 体 的 纯 度 ， 间 接 ELISA、 间 接 免 疫 荧 光 （ indirect immunoflurescence, IIF）和 Western blot 方 法 分 析 抗 体 对 RSV 融 合 蛋 白 （ fusion protein, F） 的 特 异 性 结 合 能力 ， 间 接 ELISA、 非 竞 争 ELISA 及 竞 争 ELISA 分 别 测 定 抗 体 的 亚 型 、 亲 和 常 数 和抗 原 识 别 表 位 ， 为 了 更 好 的 开 展 抗 体 生 物 活 性 研 究 ， 我 们 还 建 立 了 免 疫 酶 法（ immunoenzyne, IE） 分 析 RSV 病 毒 滴 度 的 方 法 ， 应 用 IE 法 体 外 蚀 斑 减 少 中 和 实验 ， 确 定 该 株 单 抗 的 中 和 活 性 ， 并 计 算 中 和 效 价 ，通过融合抑制实验确定该株单抗 是 否 具 有 融 合 抑 制 活 性 。 用 Trizol 法 从 杂 交 瘤 细 胞 株 中 提 取 总 RNA， 应 用 鼠 源抗 体 重 链 和 轻 链 通 用 引 物 ， 通 过 PCR 扩 增 抗 体 的 轻 链 和 重 链 可 变 区 基 因 ， 并 克 隆入 pGEM-T 载 体 中 ， 进 行 核 酸 序 列 分 析 ， 并 与 现 有 的 RSV 单 克 隆 抗 体 进 行 同 源 性比 对 。 利 用 RSV 感 染 的 动 物 模 型 ， 进 一 步 分 析 单 克 隆 抗 体 的 体 内 中 和 活 性 。6安 徽 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文结 果 ： 获 得 1 株 稳 定 分 泌 抗 RSV F 蛋 白 的 杂 交 瘤 细 胞 株 F8， 纯 化 后 抗 体 的 纯 度 达到 95%以 上 。 该 单 抗 能 够 识 别 F 蛋 白 单 体 ， 抗 体 亚 型 为 IgG1 ， 亲 和 常 数 （ Ka） 为6.8108 L/mol， 抗 原 识 别 表 位 位 于 F 蛋 白 的 抗 原 表 位 区 205-222 位 氨 基 酸 。 该 株 单抗 可 以 在 体 外 抑 制 RSV 对 HEp-2 细 胞 的 感 染 ， 具 有 中 和 活 性 ， 同 时 具 有 融 合 抑 制活 性 。 扩 增 出 抗 体 轻 链 和 重 链 可 变 区 基 因 ， 并 克 隆 入 pGEM-T 载 体 中 。 测 序 结 果显 示 重 链 可 变 区 基 因 序 列 全 长 371 bp， 编 码 124 个 氨 基 酸 ； 轻 链 可 变 区 基 因 序 列全 长 323 bp， 编 码 107 个 氨 基 酸 ， 在 GeneBank 对 氨 基 酸 序 列 进 行 比 对 分 析 ， 两 者均 符 合 小 鼠 IgG 可 变 区 基 因 的 特 征 。 与 美 国 专 利 网 上 提 交 的 具 有 中 和 活 性 的 RSV鼠 源 单 抗 的 重 链 轻 链 同 源 性 分 别 为 95.37%与 75.4%。 抗 体 体 内 保 护 实 验 显 示 ， 该抗 体 可 降 低 感 染 RSV 小 鼠 的 肺 脏 病 毒 滴 度 。结 论 ： 制 备 了 能 特 异 性 识 别 RSV F 蛋 白 的 单 克 隆 抗 体 F8， 完 成 了 纯 化 和 性 质 鉴 定 ，扩 增 出 抗 体 轻 链 和 重 链 可 变 区 基 因 ， 与 已 知 的 具 有 中 和 活 性 的 RSV 单 抗 的 可 变 区基 因 有 较 高 的 同 源 性 ， 可 以 确 定 所 得 到 的 序 列 为 RSV 抗 体 轻 链 和 重 链 可 变 区 序 列 ，而 非 其 他 基 因 的 序 列 。 以 IE 法 为 基 础 的 RSV 病 毒 滴 度 分 析 方 法 显 示 F8 在 体 内 体 外具 有 中 和 活 性 和 融 合 抑 制 活 性 ， 为 RSV 感 染 的 免 疫 治 疗 和 抗 体 人 源 化 改 造 奠 定 了坚 实 基 础 。关 键 词 ： 人 呼 吸 道 合 胞 病 毒 ； F 蛋 白 ； 单 克 隆 抗 体 ； 中 和 活 性 ； 融 合 抑 制 活 性7安 徽 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文Preparation, Characterization and Immune Protective Role ofa Monoclonal Antibody Against Human RespiratorySyncytial VirusAbstractObjective： The worldwide spread human respiratory syncytial virus (RSV) is the mostimportant etiological cause of viral lower respiratory tract illness in infants and children.So far no safe and effective vaccines are available. In this research, we used hybridomatechnology to preparare neutralizing monoclonal anbibody (McAb) against RSV, whichis of great significance in immunotherapy on RSV infection.Methods: The RSV was proliferated on HEp-2 cells and the resulting culture supernantwas used to vaccinate BALB/c mice intranasally. The Spleen cells from the mouse withthe highest titer serum was fused with myeloma cells. Hybridoma s were screened byindirect ELISA after subcloning by the limiting dilution technique. The McAb waspurified through protein G affinity chromatography, whose specificity and affinity wereanalyzed by indirect ELISA, indirect immunofluoresecnce (IIF) and Western blot. Then,the indirect ELISA, non-competitive ELISA and competitive ELISA were employed toidentify biological characteristics of this McAb including subtype, affinity and therecognized epitope. Through the immunoenzyme method, established by our group, weinvestigated the neutralizing activity and fusion inhibition capacity of McAb F8 in vitro.Later, total RNA was extracted from the hybridoma cells. The general primes specificfor VH and VL of mouse antibody were used to amplify VH and VL genes of thisMcAb. The PCR products were inserted into pGEM-T vector, sequenced and compared8安 徽 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文with the reported McAb against RSV. Animal model of RSV infection wasestablished and applied to identify the neutralizing activity of this selected McAb invivo.Result: A strain of McAb F8 against RSV fusion protein (F) was obtained. The purifiedMcAb F8 attained 95% purity and the affinity constant (Ka) and the isotype of McAbF8 was 6.8108 L/mol and IgG1, respectively. The rescognized protein and epitope ofMcAb F8 were F1 fragment of RSV F protein and amino acids 205-222. McAb F8 hadthe neutralizing activity and fusion inhibition capacity in vitro. The VH gene contained371 bp and encoded 124 amino acid residues; the VL gene contained 323 bp andencoded 107 amino acid residu