植物检疫学课程论文题目：浅谈高通量检验检测技术及问题学院：农学院专业：植物保护班级：091学号：0931100532姓名：梁琨指导老师：彭好文 屈达才浅谈高通量检验检测技术及问题摘要：本文着重介绍了高通量检验检测技术的原理，应用及其存在的问题，对植物病毒检测技术中几种常用的高通量检测方法进行综述，主要对酶联免疫吸附法、多重PCR及生物芯片检测技术的原理、特点进行了分析并指出各类高通量检验检测技术所存在的问题以及现有的解决方法，为植物的检验检测提供了理论基础。关键词：高通量 多重PCR 存在问题前言近年来，植物病毒在世界各国的危害日趋严重，所发现和报道的病毒种类日益增多，目前植物病毒分为18个科，共有近1 000种病毒，其中包括约280个暂定种。加入WTO以后，随着我国的对外开放及国际贸易不断扩大，境外植物病毒通过口岸进入境内的风险逐渐加大，我国出入境检验检疫部门面临着空前的挑战。但由于各种原因，目前植物病毒在口岸被检验检疫机关截获的机率依然不高，远远低于昆虫和真菌检出率。目前，国内针对植物病毒的检疫方法主要包括鉴别寄主反应(生物学方法)、电镜观察、血清学试验、和分子生物学手段。聚合酶链式反应(PCR)技术是一种在体外快速扩增特定DNA序列的方法。PCR及其相关技术以其快速、灵敏和准确等优点已广泛应用于植物病害的检测研究。多种PCR方法被应用到植物病毒的检测中，但同样存在着假阳性或假阴性问题，且这些检测技术通常每次只能检测一种病毒，无法满足快速通关要求。因此，在口岸植物检疫方面，高通量是目前植物病毒检测的发展方向。 高通量检测技术高通量检测技术是指一次可检测多个样品或对同一样品进行多种检测的技术。高通量检测技术就包括酶联免疫吸附测定技术，多重PCR技术，基因芯片检测技术等。他们都是可以一次检测多个样品或对同一样品进行多种检测的技术。多重PCR技术多重PCR是在PCR基础上发展起来的一种可以同时检测两个或两个以上日的基因片段的PCR方法，主要原理是设计两对或两对以上引物，在同一个PCR反应体系中，同时扩增一份DNA样品中几个不同DNA目的片段。该方法既有单个PCR的特异性和敏感性，还能提供内部对照，指示模板数量和质量。与常规方法相比，多重PCR反应方法相同，但在反应中加入的是多对引物，而不是一对引物。多重PCR技术在植物检疫方面的目标是，能够直接检测同时受多种病毒侵染的植物，以达到快速检测的要求。在确立多重PCR实验方案时，要特别重视优化体系中的主要成分和反应条件。当确立了一个成熟的反应后，要视不同的模板和引物对实验条件加以调整，以保证结果的特异性和可靠性。多重PCR具有单个PCR无法比拟的优越性，消耗时问和试剂少，减轻了工作量，一次反应可以同时检测多个基因，同时还可以提供内部参照，有效防止假阴性或假阳性对结果的干扰。目前，尽管已在植物病毒检疫领域建立了多重PCR的检测方法，但是多重PCR方法本身还存在一些普遍的问题：特异性和灵敏度低；某一特定片段的优先扩增；容易引起引物二聚体；重复性不好。这些问题需要在不断优化反应条件中逐步解决。多重PCR要求不同引物能在同一反应体系中进行特异性扩增，因而影响其扩增效果的因素较多。其中，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与敏感性，因此引物设计要合理，并且一个成功的引物浓度配比需要经过多次重复试验来调整。反应条件的优化是多重PCR成功的关键，要比常规PCR复杂得多。生物芯片技术人类基因组计划(HGP)的完成和蛋白质组计划(HPP)的启动，获得了海量的基因和蛋白质信息，要对规模如此庞大的信息进行全面的处理和研究，必须设计和利用更为高效的硬件和软件技术，建立新型、高效、快速的检测分析方法。生物芯片正是在这种背景下应运而生，它不仅在高通量基因测序、基因表达研究、蛋白质相互作用等方面发挥重要作用，亦将在植物检疫中占据重要地位。所谓生物芯片是指通过微加工技术将大量可寻址的生物识别分子如核酸片段、多肽分子甚至细胞、组织片断等按照预先设置的排列方式固定在厘米见方的芯片片基上，使芯片上每个坐标点就代表一个探针分子，利用生物分子之间的特异性亲和反应，实现对基因、配体、抗原等生物活性物质的检测分析。按反应载体可分为固相芯片和液相芯片。固相芯片发展较早，可以同时分析多种生物分子，具有高通量、高灵敏度和并行检测的特点，但是其信息质量的稳定性和可重复性比较差，且无法实现定量检测。酶联免疫吸附测定技术酶联免疫吸附测定技术是把抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机地结合在一起，使对抗原和抗体的检测和定量可以通过简单的颜色反应实现，是目前植物病毒检测中应用的最广泛的方法。与其他方法相比，该方法具有灵敏度较高、操作简单、特异性好、安全并可同时处理大批量样品、同时做几种病毒检测的优势。目前常用的酶联免疫吸附测定方法有直接法、间接法、双抗体夹心法、三抗体夹心法以及竞争酶联免疫吸附测定等。尽管酶联免疫吸附测定作为一种重要的高通量检测方法常常在实际检测过程中被应用，但这种方法也存在一些不足。只能检测蛋白，一些类病毒或极不稳定的病毒则无法通过该方法进行检测；酶联免疫吸附测定检测结果的好坏通常依赖于抗血清的品质，如果血清质量不高，容易出现假阳性或假阴性的结果；由于在国内购买血清的时间比较长，所以ELISA方法无法应付紧急的检测任务。酶联免疫吸附测定方法在实际检测过程中可以作为一种很好的初筛选择，在检测到阳性结果后，必须结合PCR、电镜等方法进行验证。酶联免疫吸咐实验中不同类型的酶免疫测定法， 在检测同一抗原或抗体时， 其敏感性和特异性也有差异。因此选择适宜的酶免疫测定法，是取得酶免疫测定正确结果的因素之一。结语目前，植物病毒的检测方法对口岸检疫部门要求较高，很多一线检疫部门不具备开展病毒检测工作的条件。传统的生物学检测方法所需时间太长，不适于口岸部门进行检测。多重PCR及其相关技术的灵敏性是其他常规检测手段所不能比拟的。植物检疫检测技术期望能够达到准确、快速、简便、高通量4项要求。其中准确最为重要，不准确的检测结果是毫无意义的。其次是快速，这对于阻挡重要疫病原的入侵、蔓延将至关重要。当准确和快速均符合要求时，简便的操作模式则是另一个考虑因素。由于送样至待定实验室需花费时间，此过程也会增加受污染几率，加之受技术、设备、研究人员等因素的限制，故简便的操作技术与过程，将是检测鉴定技术能否普及的关键因素。目前大多数检测技术难以在准确、快速、简便与高通量上达到平衡，PCR、ELISA等技术已经初步到达上述要求，不过在实效性、简便性方面仍存在许多不足；另一方面，应用胶体金免疫层析法所开发的产品，如试纸条等，其在实效性及简便性上有相当大的突破，但灵敏度、高通量上仍有不足。随着植物检疫的发展及生物芯片技术的诞生，高通量检测技术又有了重大的突破。所以此方法是目前符合植物检疫鉴定所要求准确、快速、灵敏、简单、高通量等要求的最佳技术。参考文献1吴云峰植物病毒学原理与方法M西安：西安地图出版社，19992牛建新，陈萍葡萄病毒多重RTPCR检测技术体系优化分析果树学报，2004，21(2)：120123.3黄粤，马荣群，岳文辉应用RTPCR方法检测辣椒轻微斑驳病毒.山东农科学，2004(5):5657.4孙伟，焦 奎酶联免疫吸附分析法在植物病毒检测中的应用化学研究与应用，2002,14(5):51l514.5施曼玲，周雪平.植物病毒的诊断技术.微生物学通报，2000，27(2)：149151.6易汪雪 ，陈舜胜等.高通量检测技术在植物病毒检疫中的研究应用及前景. 湖南农业科学2010，(17)：1051087陈建军，刘崇怀，古勤生，等DASEL ISA、RTPCR 和ICRTPCR检测葡萄卷,f-病毒 的比较研究果树学报，2003，2O(3)：173177.8毛钧，蔡青，李文凤，等甘蔗宿根矮化病巢式PCR检测体系.中国糖料，2009(2)：3132