如何提高灵敏度液质联用技术在药物代谢动力学中的应用二炮总医院药剂科2药物代谢动力学的主要研究内容吸收(Absorption)分布(Distribution)代谢(Metabolism)排泄(Excretion)A D M E生物样品分析3生物样品分析技术HPLCUV经典分析方法HPLCMS/MS新技术0500100015002000250030000121604 8 204 只能用于对紫外线有吸收的组分的检测。紫外检测器的原理是通过检测器的组分，对特定波长紫外的吸收服从 Lamert-Beer定律。 紫外检测器的色谱图是紫外吸收随时间变化的函数 几乎任何一种有机物都有紫外吸收所以紫外检测器的专属性比质谱要差。紫外检测器原理5质谱检测器原理 只要被测化合物能构被离子化，质谱是能检测到带电的离子，最后得到的是离子强度随时间变化的函数称质量色谱图 质量是化合物的特有性质之一，所以质谱检测要优于紫外检测。6液相质谱检测 MRM色谱图0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3 1.5 1.7 1.9Time, min0%20%40%60%80%100%Rel. Int. (%)0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3 1.5 1.7 1.90%20%40%60%80%100%Rel. Int. (%)70%50%100%TIC m/z 2005000%50%100%12.51m/z 2270%50%100%10.66m/z 2090%50%100%1 3 5 7 9 11 13 15 17 197.16m/z 2250%50%100%7.13m/z 385质谱检测的优势8液相色谱及液质联用技术在药物分析方面发表论文统计图01002003004005006007008001990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003LC/MSOnly LC9如何提高分析方法的灵敏度 样品处理过程 进样量 HPLC条件的优化 MS条件的优化10一、处理样品方法的选择样品 液液萃取（可以起到浓缩待测物的作用） 固相萃取SPE（也可以浓缩但成本高） 沉淀蛋白（稀释样品） 有机溶剂沉淀法 盐沉淀法 强酸沉淀法11二、进样量进样量直接影响信号的响应，大进样量可以提高灵敏度，但是受色谱柱载样量的限制，而且对色谱柱及质谱仪的损害较大。所以应当越小越好。溶解样品的溶剂也会直接影响色谱行为进样体积也会影响峰型在梯度洗脱时，可以加大进样量以提高灵敏度12三、 HPLC条件的优化 I 色谱柱选择 由于 LC MS分析对色谱分离要求不是很高。所以可以使用短的色谱柱，这样可以节省流动相用量，缩短分析时间 而且使用短色谱柱还能提高灵敏度 流动相中有机相比例尽量高。还可以在流动相中加入一些化合物来提高质谱的信号强度（如甲酸，一些醚类） 针对不同的分析物选择相应的色谱柱13三、 HPLC条件的优化 I 色谱柱选择 要对各种厂家的色谱柱有所了解对于一些特殊的化合物必需使用特殊的色谱柱进行分离 相关的知识可以向色谱柱供应商索取 大多数著名的色谱柱厂商都有自己的色谱柱分析数据库里面可能会有你意想不到的信息14三、 HPLC条件的优化 II 流动相的选择 与传统的 HPLC UV分析有所不同，在 HPLC MS分析中，要求流动相的有机相比例越大越好，出峰时间尽量靠前（在没有基质效应的情况下） 流动相中不能有不可挥发性的盐如磷酸盐 有些在 HPLC中使用的扫尾剂如三乙胺和离子对试剂三氟乙酸都会影响质谱的响应信号15三、 HPLC条件的优化 III 流速的影响 流速对 LC MS分析有影响 MS属于质量型检测器与流速有关 UV属于浓度型检测器与流速无关 对反相色谱而言，提高有机相比例色谱峰会提前， UV峰面积不会变化， MS的峰面积会增大很多 提高流速同样是 LC MS分析提高灵敏度的方法之一16min0 0.5 1 1.5 2 2.5 3mAU0204060801.939分流对紫外检测的影响17黄色 0.5 mL/min白色 1.0 mL/min红色 2.0 mL/minmin0 1 2 3 4 5 6 7 8 9mAU-20020406080100120140Area: 2028High: 1427.653.911.94Area: 1021High: 110Area: 544High: 85流速对保留时间及峰面积的影响1805001000150020002500300035000123456time (min)peak height05001000150020002500300035000123456time (min)peak height有机相比例对出峰时间和峰面积的影响19三、 HPLC条件的优化 IV 洗脱方式 一般采取等梯度洗脱，这样分析速度快 但有时也会采取梯度洗脱如分析多肽类化合物一般采取梯度洗脱，此时的信号会比等梯度洗脱时强很多，而且可以加大进样量。是提高灵敏度的一种措施，但是分析时间较长。需要有平衡的时间。2001002003004005000 2 4 6 8 101214161820time (min)peak height020406080100梯度洗脱问题21020406080100梯度洗脱问题梯度延迟22三、 HPLC条件的优化 IV 柱温对色谱行为的影响 依那普利NHONHOOCCH3O OH3CCOOH23特殊问题 疏水崩塌HO HHO HHO HHO HHOHO HHO HHO HHO HHO HHO HHO HHO H HO HHO H24四、质谱条件的优化I HPLC MS分析的灵敏度之所以比 UV高就在于质谱的灵敏度很高，而且选择性很好，尤其是 MRM方式在生物样品分析中能有效的排除杂质的干扰。甚至于可以不处理生物样品直接进行分析。25四、质谱条件的优化 II MS条件的优化主要目的是尽量提高待测物的质谱响应信号。主要参数有 ESI 喷雾电压、 APCI的电流、 DP值 、 碰撞能量 ， 雾化气 辅助气 的流速，离子源的温度。 另外还有质谱的分辨率也会影响信号强度26四、质谱条件的优化 II 质谱的分辨率影响信号强度709.5710.5711.501003005000 500 1000 1500 2000m/zpeak height709.5490.4230.31300.4H0.7amuH709.527数据采集速度28数据采集速度2901002003004005000 2 4 6 8 101214161820time (min)peak height质谱扫描时间的影响30如何提高灵敏度 总结HPLC条件的优化9色谱柱选择9流动相的选择流速的影响洗脱方式9柱温9疏水崩塌MS条件的优化9质谱参数优化9DP CE Gas9分辨率调整9采集速度等