分类号 R71 密级U D C100211硕 士 学 位 论 文天花粉蛋白核糖体活性位点的删除及其对 APC 基因甲基化作用的影响学 位 申 请 人： 曹 卫 红学 科 专 业： 妇 产 科 学指 导 教 师： 黄 利 鸣 教授王 艳 林 教授二 一 一 年 三 月IA Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of theRequirements for the Degree of Master of MedicineDelete the RIPs of Trichosanthin and effection onpromoter methylation state of the APC geneGraduate Student: Cao WeihongMajor: Obstetrics and GynecologySupervisor: Prof. HuangLimingProf. WangYanlinChina Three Gorges UniversityYichang, 443002, P.R.ChinaMarch, 2011II三 峡 大 学 学 位 论 文 原 创 性 声 明本 人 郑 重 声 明 ： 所 呈 交 的 学 位 论 文 ， 是 本 人 在 导 师 的 指 导 下 ， 独 立 进 行 研 究 工 作所 取 得 的 成 果 ， 除 文 中 已 经 注 明 引 用 的 内 容 外 ， 本 论 文 不 含 任 何 其 他 个 人 或 集 体 已 经发 表 或 撰 写 过 的 作 品 成 果 。 对 本 文 的 研 究 做 出 重 要 贡 献 的 个 人 和 集 体 均 已 在 文 中 以 明确 方 式 标 明 ， 本 人 完 全 意 识 到 本 声 明 的 法 律 后 果 由 本 人 承 担 。学 位 论 文 作 者 签 名 ：日 期 ：三 峡 大 学 研 究 生 知 识 产 权 承 诺 书本 人 承 认 ： 我 作 为 三 峡 大 学 硕 士 研 究 生 在 校 期 间 学 习 ， 在 导 师 的 指 导 下 ， 依 据 研究 工 作 所 作 学 位 论 文 的 知 识 产 权 全 部 归 三 峡 大 学 所 有 。本 人 承 诺 ： 我 有 义 务 维 护 三 峡 大 学 的 知 识 产 权 ， 凡 是 以 我 本 人 学 位 论 文 的 全 部 或部 分 研 究 成 果 ， 或 实 验 数 据 为 基 础 所 形 成 的 研 究 论 文 及 成 果 ， 无 论 是 以 何 种 形 式 刊 发学 位 论 文 、 进 行 成 果 鉴 定 或 申 报 奖 励 ， 均 以 三 峡 大 学 为 第 一 作 者 单 位 或 完 成 单 位 ， 并事 先 征 得 导 师 或 学 校 相 关 部 门 的 同 意 。我 愿 承 担 因 违 背 上 述 承 诺 而 引 起 的 一 切 法 律 和 经 济 成 果 。学 位 论 文 作 者 签 名 ：日 期 ：III三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文内 容 摘 要目 的 ： 宫 颈 癌 的 发 生 、 发 展 中 存 在 DNA 甲 基 化 水 平 和 模 式 的 紊 乱 ,DNA 甲 基 化 异常可影响癌基因和抑癌基因的表达而参与肿瘤的形成。天花粉蛋白（TCS）具有对多种 高 甲 基 化 状 态 的 抑 癌 基 因 启 动 子 进 行 去 甲 基 化 的 作 用 ， 并 由 此 上 调 这 些 抑 癌 基 因 的表 达 水 平 ， 但 是 TCS 发 挥 去 甲 基 化 的 机 制 尚 未 阐 明 。 在 前 期 天 然 天 花 粉 蛋 白 （ nTCS）能 够 抑 制 宫 颈 癌 细 胞 增 殖 和 逆 转 抑 癌 基 因 启 动 子 甲 基 化 的 研 究 基 础 上 ， 本 课 题 重 点 研究 nTCS 抗 宫 颈 癌 和 去 甲 基 化 的 机 制 。方 法 ： 1.利 用 重 叠 延 伸 PCR 得 到 活 性 位 点 突 变 的 天 花 粉 蛋 白 （ mTCS） 的 目 的 片段 ， 将 其 插 入 到 pET-28a(+)空 载 中 ， 成 功 构 建 的 表 达 质 粒 pET-28a(+)-mTCS 转 化 入E.coli BL21(DE3)细 胞 ， IPTG 诱 导 表 达 mTCS， 用 金 属 镍 螯 合 层 析 法 纯 化 mTCS 后 进 行Western-blot 鉴 定 ； 2.酶 活 性 分 析 检 测 mTCS 生 物 活 性 ， MTT 法 检 测 mTCS 和 nTCS 对宫 颈 癌 HeLa 细 胞 增 殖 的 影 响 ,流 式 细 胞 术 检 测 mTCS 和 nTCS 对宫颈癌细胞周期的影响 ； 3 甲 基 化 特 异 性 PCR(MSP)检测人宫颈癌 Hela 细 胞 中 APC 基因启动子区域 CpG 岛甲 基 化 状 态 ， 反 转 录 PCR（ RT-PCR） 和 半 定 量 PCR 法 研 究 mTCS 和 nTCS 对 APC 基 因 mRNA表 达 水 平 的 影 响 ,Western-blot 法 检 测 mTCS 和 nTCS 对 APC 基 因 蛋 白 表 达 水 平 的 影 响 。结 果 ： 1.IPTG 可 诱 导 mTCS 在 E.coli 中表达，温度较低的培养环境（30）有利 于 表 达 ； 用 Ni2+-NTA 树 脂 亲 和 层 析 法 从 诱 导 表 达 菌 中 获 得 了 较 高 纯 度 的 mTCS； DNA酶 活 性 检 测 发 现 删 除 核 糖 体 活 性 位 点 的 天 花 粉 蛋 白 体 外 切 割 超 螺 旋 DNA 的 作 用 丧 失 ；2.MTT 法 分 析 表 明 在 0-100 g/mL 的 浓 度 范 围 内 ， 随 着 药 物 浓 度 的 增 加 ， nTCS 对 HeLa细 胞 的 生 长 抑 制 率 逐 渐 增 大 ， 与 对 照 组 相 比 存 在 显 著 差 异 （P 0.01） ， 不 同 浓 度 mTCS处 理 对 细 胞 生 长 没 有 明 显 的 抑 制 作 用 ； 流 式 细 胞 仪 检 测 发 现 nTCS 可 以 阻 滞 细 胞 于 S期，从而抑制宫颈癌细胞生长，mTCS 不能发挥这一作用；3.MSP 法检测发现宫颈癌HeLa 细 胞 中 APC 基 因 为 高 甲 基 化 状 态 ， 80mg/L nTCS 处 理 48h 后 ， APC 基 因 启 动 子 区去 甲 基 化 ， 但 是 经 80mg/L mTCS 处 理 后 APC 基 因 高 甲 基 化 状 态 没 有 改 变 ； RT-PCR 分析 发 现 ， 在 TCS 处 理 前 APC 基 因 mRNA 水 平 为 低 表 达 ， 经 80mg/L 的 mTCS 处 理 后 mRNA表 达 水 平 没 有 变 化 ， 但 经 80mg/L 的 nTCS 处 理 后 mRNA 表 达 水 平 显 著 升 高 ；Western-blot 法 检 测 Hela 细 胞 APC 蛋 白 水 平 的 变 化 发 现 ， 与 对 照 细 胞 比 较 ， 80mg/LII三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文mTCS 处 理 的 Hela 中 APC 蛋 白 含 量 无 显 著 变 化 ， 但 经 80mg/L nTCS 处理的细胞内 APC蛋 白 含 量 显 著 增 高 。结 论 ： 本 实 验 成 功 地 在 E.coli 中 原 核 表 达 和 纯 化 出 mTCS， DNA 酶 活 性 检 测 发 现删 除 核 糖 体 活 性 位 点 的 天 花 粉 蛋 白 体 外 切 割 超 螺 旋 DNA 的 作 用 丧 失 , nTCS 能 够 抑 制宫 颈 癌 HeLa 细 胞 的 增 殖 ， 并 且 能 够 阻 滞 HeLa 细 胞 周 期 于 S 期 ， 从 而 发 挥 抗 肿 瘤 药 理作 用 。 纯 化 的 mTCS 对 HeLa 细 胞 的 增 殖 没 有 明 显 抑 制 作 用 。 宫 颈 癌 HeLa 细 胞 中 APC基 因 为 高 甲 基 化 状 态 ， nTCS 能 逆 转 宫 颈 癌 HeLa 细 胞 APC 基 因 高 甲 基 化 状 态 ， 上 调 APC基 因 mRNA 和 蛋 白 水 平 的 表 达 ， 但 是 mTCS 没 有 这 些 作 用 。 上 述 研 究 提 示 ， 天 然 天 花 粉蛋 白 发 挥 其 抗 癌 作 用 和 去 甲 基 化 作 用 与 其 蛋 白 分 子 内 核 糖 体 失 活 功 能 位 点 相 关 。关键词：天花粉蛋白；核糖体活性；APC 基因；宫颈癌；DNA 甲 基 化III三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文AbstractObjective： The disorders of DNA methylation pattern involves in the development ofcervical cancer. DNA methylation abnormalities may affect expression of oncogenes andtumor suppressor gene that participates in tumor formation. Trichosanthin (TCS) candemethylate multiple tumor suppressor genes with high methylation status in theirpromoters, thus increase the expression of these tumor suppressor genes. But underlinemechanism of demethylation for TCS has not yet elucidated. In our early studies, thenatural trichosanthin (nTCS) has shown the functions to inhibit cancer cell proliferationand reverse promoter methylation in tumor suppressor genes. Based on these results, thisproject will focus on the mechanisms underling the nTCSfunctions in anti-cervical cancerand in demethylation.Methods: PCR-driven overlap extension was used to obtain a mutated TCS (mTCS)with deletion of the active site in TCS. mTCS was inserted into pET-28a(+), Resultedplasmid pET15b/mTCS was transformed into E. coli and mTCS was expressed by IPTGinduction and purified by Ni-NTA resin. MTT method was performed to assay the effectsof mTCS and nTCS on proliferation of HeLa cells.