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离子交换层析法 (Ion exchange chromatography)1. 1 基本原理:包括离子交换法的原理和步骤。1. 2. 树脂材质:介绍常用的阴阳离子交换树脂成份。2. 3. 离子交换剂的选择:如何选用适当的阴(阳)离子交换剂和缓冲液。3. 4. 离子交换树脂的前处理:使用树脂前的注意事项和处理方法。一、基本原理离子交换层析法 (ion exchange chromatography,简称 IEC)是从复杂的混合物中,分离性质相似大分子的方法之一,依据的原理是物质的酸碱性、极性,也就是所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质,对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力,改变冲洗液的离子强度和 pH 值,物质就能依次从层析柱中分离出来。离子交换层析法大致分为 5 个步骤:1. 1. 离子扩散到树脂表面。2. 2. 离子通过树脂扩散到交换位置。3. 3. 在交换位置进行离子交换;被交换的分子所带电荷愈多,它与树脂的结合愈紧密,也就愈不容易被其它离子取代。4. 4. 被交换的离子扩散到树脂表面。5. 5. 冲洗液通过,被交换的离子扩散到外部溶液中。离子交换树脂的交换反应是可逆的,遵循化学平衡的规律,定量的混合物通过管柱时,离子不断被交换,浓度逐渐降低,几乎全部都能被吸附在树脂上;在冲洗的过程中,由于连续添加新的交换溶液,所以会朝正反应方向移动,因而可以把树脂上的离子冲洗下来。如果被纯化的物质是氨基酸类的分子,则分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的 pH 值,所以当溶液的 pH 值较低,氨基酸分子带正电荷,它将结合到强酸性的阳离子交换树脂上;随着通过的缓冲液 pH 逐渐增加,氨基酸将逐渐失去正电荷,结合力减弱,最后被洗下来。由于不同的氨基酸等电点不同,这些氨基酸将依次被洗出,最先被洗出的是酸性氨基酸,如 apartic acid 和 glutamic acid(在约 pH34 时),随后是中性氨基酸,如glycine 和 alanine。碱性氨基酸如 arginine 和 lysine 在 pH 值很高的缓冲液中仍带有正电荷,因此这些在约 pH 值高达 1011 时才出现。二、树脂材质 最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯-苯二乙烯(polystyrenedivinylbenzene),它是由苯乙烯(styrene)和苯二乙烯(divinylbenzene )聚合产生的三维网状结构,举例来说,Dow 化学公司所生产的树脂 Dowex 508,表示含 8%苯二乙烯。根据交换树脂的性能,分为阳离子与阴离子交换树脂。1. 阳离子交换树脂分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类,强酸型树脂含有R SO 3H,中强酸型树脂含有PO 3H2、PO 2H2 或OPO 2H2,弱酸型树脂含有COOH 或OH。阳离子交换树脂进行的反应如下图一:图一 图二2. 阴离子交换树脂分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类,含有铵盐,四级铵盐 N +(CH3)3 为强碱型树脂,三级以下铵盐 N(CH 3)2、 NHCH 3、 NH 2 都属弱碱型树脂;同时具有强碱和弱碱型基团的,为中强碱型的树脂。阴离子交换树脂进行的反应如图二:除了树脂以外,纤维素(cellulose)、葡聚糖凝胶(Sephadex gel)和琼脂糖凝胶(Sepharose)也是常用的离子交换材质,特性是具有亲水性和较大的表面积,对生物活性物质而言,是一个较为温和的环境,同时也是大分子所适用的分离纯化材质 。常用的种类如图三:图三实验证明,纤维材质对蛋白质和核酸的分离纯化效果相当好,因为离子交换纤维的种类多,能依据不同分离目的使用,且功能团基主要在表面,对生物大分子的交换十分有利。三、离子交换剂的选择离子交换剂的选择,首重保持欲分离物质的生物活性,以及在不同 pH 值环境中,此物质所带的电荷和电性强弱。1. 阴阳离子交换剂的选择若被分离物质带正电荷,例如 polymyxin、 cytochrome C 这些碱性蛋白质,它们在酸性溶液中较稳定,亲和力强,故采用阳离子交换剂;其它像 heparin、nucleic acid 这类酸性物质,在碱性溶液中较稳定,则使用阴离子交换剂;如果欲分离的物质是两性离子,一般考虑在它稳定的 pH 范围带有何种电荷,作为交换剂的选择。以胰岛素(insulin )为例,它的等电点为 pH 5.3,因此在 pH5.3 的碱性溶液中,使用阴离子交换剂。简言之,已知等电点的物质,在高于等电点的 pH 条件下,因带有负电荷,应采用阴离子交换,在低于等电点的 pH 下,则采用阳离子交换。未知等电点的物质,在一定 pH 条件下进行电泳,向阳极移动较快的物质,在同样条件下可被阴离子交换剂吸附,向阴极移动较快的物质可被阳离子交换剂吸附。1. 2. 缓冲液的选择缓冲液酸碱度的选择,决定于被分离物质的等电点、稳定性、溶解度和交换剂离子的pK 值。使用阴离子交换纤维时要选用低于 pK 值的缓冲液,若欲分离的物质属于酸性,则缓冲液的 pH 值要高于该物的等电点;用阳离子交换纤维时要选用高于 pK 值的缓冲液,目的物属于碱性物质的话,缓冲液要低于该物等电点的 pH 值。缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解度、不发生沉淀为原则,如使用 UV 吸收法测样品,那么 pyridine 或 barbital 这类会吸收 UV 的物质就不适用。 四、离子交换树脂的前处理离子交换树脂使用前,先以蒸馏水除去其内之杂质 ,并以 NaOH 和 HCl 处理树脂,使其上的官能基完全露出。阴离子交换树脂先以 15 倍于树脂量的 0.5 N HCl 浸泡 30120分钟,再以水清洗至 pH 7.0,之后用 0.5 N NaOH 浸泡 30120 分钟,同样以水清洗至 pH 7.0,最后用欲使用的缓冲液浸泡。阳离子交换树脂用 15 倍于树脂量的 0.5 N NaOH 浸泡30120 分钟,以水清洗至 pH 7.0,之后用 0.5 N HCl 浸泡 30120 分钟,再以水清洗至 pH 7.0,最后用欲使用的缓冲液浸泡。详细操作方法离 子 交 换 树 脂 的 使 用 说 明一、贮存与运输离子交换树脂一般是在充分膨胀、湿润的球粒状态下供应,在贮存、运输过程中要保持包装完好无损,避免树脂脱水、冻裂及污染。不能露天存放,存放处的温度为 040,当存放处温度稍低于 0时,应向包装内加入澄清的饱和食盐水,浸泡树脂。此外,当存放处温度过高时,不但使树脂易于脱水,还会加速阴树脂的降解。一旦树脂失水,使用时不能直接加水,可用澄清的饱和食盐水浸泡,然后再逐步加水稀释,洗去盐分,贮存期间应使其保持湿润。二、脱水树脂复苏树脂干燥失水是最大危险之一,失水树脂用 10%食盐水浸泡 12 小时,然后稀释,再投入使用,以防止树脂水合急剧膨胀而破损。三、树脂鉴别使用单位存放树脂和填装时发生混淆,必须鉴别,确认后,投入装置,以充分发挥树脂的工作性能。1、鉴别 0017 和 2017 两种树脂,可以利用湿真密度不同而区别,取一点树脂放入饱和食盐盐水中,浮在上面的是 2017 阴树脂,下沉的则是 0017 阳树脂。2、鉴别强弱型阳树脂,一是外观,强酸性阳树脂为棕黄色,弱酸性阳树脂为乳白色或淡黄色,二是用转型膨胀率判断,阳树脂用盐酸转为 H 型,再用烧碱转为 Na 型,是其体积膨胀,弱酸性树脂明显大于强酸性树脂。3、鉴别强弱型阴树脂,可以利用加酚酞的氢氧化钠浸泡 10min,用无离子水洗净后,强型阴树脂呈紫色,大孔强型阴树脂呈粉红色,弱型阴树脂不变色。四、树脂预处理将准备装柱使用的新树脂,先用热水(清洁的自来水也可)反复清洗,阳离子交换树脂可用 7080的热水,阴离子交换树脂的而热性能较差一些,可用 5060热水。开始浸洗时,每隔 15 分钟换水一次,浸洗时要不时搅动,换水 45 次后,可隔约 30 分钟换水一次,总共换水 78 次,浸洗至浸洗水不带褐色,泡沫很少时为止。水洗后,再经酸碱处理,阳离子交换树脂可按下述步骤处理:1、用 1N 盐酸缓慢流过树脂,用量约为强酸阳树脂体积的 23 倍,弱酸阳树脂体积的 35 倍,每小时 1.5 倍床层体积流过。(一般用 1.52.0 mol/L HCl, 质量分数约为46%, 1.52BV 是指酸用量(床层体积的倍数) 。配制方法:1ml 浓盐酸稀释至 8ml,此时其浓度为 4.5%,1.5mol/L)2、用水冲洗,出水 PH 为 5 左右,用 3 倍树脂体积 5%的 NaCl 溶液流过树脂,流速与1 相同。3、用 1NNaOH 流过树脂,用量及流速与 1 相同。4、用水冲洗至出水 PH 为 9 左右。5、用 1N 盐酸或硫酸,将树脂转成 H-型,用量为树脂体积的 35 倍,流速与 1 相同。6、酸流完后,用去离子水冲洗至出水 PH 值为 6 以上时,即可投入使用。对于阴离子交换树脂水洗后的酸、碱处理次序,可采用碱 酸 碱次序,酸、碱用量及流速,与阳树脂相对应,弱碱阴树脂与弱酸阳树脂相对应。五、离子交换树脂的复活处理1、铁污染:树脂被铁污染后,颜色变深甚至发黑,可以用二倍树脂体积 10%的盐酸,以约 0.6m/h 流速通过树脂层,然后用同样流速 40的清水清洗,最后用过量的 NaOH 再生(阳树脂)。2、硅污染:被树脂吸附的硅酸,在低 PH 的条件下,容易聚合为高聚物沉淀于树脂中,可用 4050,6%8%NaOH 溶液浸泡,再用清水洗,为避免硅污染,应适当提高再生剂的浓度和温度。3、有机物污染:阴树脂很容易被水中的有机物污染,使树脂变色发黑,水的电导上升,PH 值下降,功效降低,这样可用 10 倍树脂体积,温度为 40的 8%的 NaCl 和 4%的NaOH 混合液,以 0.6m/h 的流速通过树脂层,或采用浸泡 24h,可获得较好的复苏效果。
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