1实验原理与方法蔬菜生理与生态实验室南京农业大学园艺学院二零零九年十月2目 录1、氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）2、POD（过氧化物酶）活性的测定愈创木酚法3、CAT(过氧化氢酶)测定4、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定5、谷胧甘肽还原酶(GR)的活力测定:6、O 2-产生速率的测定7、过氧化氢(H2O2)含量的测定碘化钾分光光度法8、丙二醛（MDA）含量的测定9、还原型抗坏血酸（ASA）和脱氢抗坏血酸（ DHA）的测定10、谷胱甘肽还原酶测定11、MDAR(单脱氢抗坏血酸还原酶) 活性的测定12、可溶性总糖的测定13、考马斯亮蓝 G-250 染色法测定可溶性蛋白含量14、叶绿素含量的测定15、石蜡制片的制作16、激素 Indole-3-Acetic Acid（IAA） 、Abscisic Acid（ABA） 、GA 3 和 ZA 的测定17、cDNA 扩增片段长度多态性技术（cDNA-AFLP）18、3/5RACE 扩增基因全长19、根系活力的测定（TTC法）1一 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）【实验原理】SOD 是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的 SOD：MnSOD 和Cu.ZnSOD ，它们都催化下列反应：由于超氧自由基（O 2. ）为不稳定自由基，寿命极短，测定 SOD 活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定 SOD 的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子 O2. ，当加入 NBT 后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲 月 替 （ 黄 色 ） ，继而还原生成二甲月 替 ， 它是一种蓝色物质，在 560nm 波长下有最大吸收。当加入 SOD时，可以使超氧自由基与 H+结合生成 H2O2 和 O2，从而抑制了 NBT 光还原的进行，使蓝色二甲月 替 生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的 SOD 酶液，光照一定时间后测定560nm 波长下各液光密度值，抑制 NBT 光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1. 分光光度计2. 台式离心机（二）材料1. 磷酸氢二钠2. 磷酸二氢钠3. 甲硫氨酸4. EDTA-Na25. 核黄素6. 氮蓝四唑(NBT)7. 陶瓷小研钵8. 4-5ml 离心管9. 10ml 玻璃试管（三）试剂21. 0.05mol/L 磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A 母液：0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液: 取 Na2HPO412H2O（分子量 358.14）71.7g；B 母液 ：0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取 NaH2PO42H2O（分子量 156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到 1000ml。0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取 A 母液(Na 2HPO4) 228.75ml，B 母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至 1000ml。2. 14.5mM 甲硫氨酸溶液：称取 1.0818g Met 用磷酸缓冲液 （pH7.8）定容至 500ml。3. 3mM EDTA-Na2 溶液： 称取 0.1117g EDTA-Na2 用磷酸缓冲液定容至 100ml。4. 60M 核黄素溶液：称取 0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至 100ml，避光保存。5. 2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：称取 0.092g NBT 用 PBS 定容至 50ml，避光保存。【实验步骤】1. 酶液提取 称取 0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入 1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液（pH7.8 ）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在 4、12000g 下离心 20min，上清夜即为 SOD 粗提液。2. 酶活性测定（1）反应混合液配制(以 60 个样为准)：分别取配好的 Met 溶液 162ml，EDTA-Na 2溶液 6ml， NBT 溶液 6ml，核黄素溶液 6ml,混合后充分摇匀；（2）分别取 3ml 反应混合液和 40l（可视情况调整）酶液于指形管中此即反应管；同时做两支对照管，其中 1 支试管加 3ml 反应混合液和 40l PBS（不加酶液）作为最大光还原管，另 1 支加 3ml 反应混合液和 40l PBS 同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。（3）将试管置于光照培养箱中在 4000 lux 光照 25下反应 20min；（4）反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在 560nm 下的吸光度（OD 560）3. 计算结果已知 SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原的 50为一个酶活单位（ U） ，按下式计算活性n=(ODmax-OD560)/ODmax/2SOD 总活性 ( Ack-AE )V/（1/2A ckWVt） SOD 比活力SOD 总活性/蛋白质含量SOD 总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW） ；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack 为照光对照管的吸光度；A E 为样品管的吸光度； V 为样品液总体积（ml） ；Vt 为测定时的酶液用量（ml） ；W 为样品鲜重（g） ；蛋白质含量单位为 mg/g。3【注意事项】1. 酶液提取须在 4下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降；2. 植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或 pvpp 等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。3. NBT 反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。4. 加反应液时最好在暗光下进行；5. 核黄素产生 O2.，NBT 还原为篮甲潛都与光照密切相关，照光强度和时间要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达 40molm -2s-1，同时使照光时间一样，选择试管尽量一致，照光结束后测一个拿一个（最好晚上做） （温度高时照光时间缩短，温度低时延长） ；6. 测定活性时加入的酶量，以能抑制反应的 50为佳。 （一个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量，即以能抑制反应 50的酶量为一个 SOD 酶活性单位。 ）（反应液中加酶液与 PBS 调零差异不大，反应液调零与其它两个则有一定差异。李合生方法：2 支 CK 管均以缓冲液代替酶液。 ）【参考文献】Beauchamp C, Fridovich I. Superoxide dismutase. Improved assays and an assay applicable to acrylamide gel. Anal Biochem, 1971, 44: 276-287. Zhou W, Zhao D, Lin X. Effects of water logging on nitrogen accumulation and alleviation of waterlogging damage by application of nitrogen fertilizer and mixtalol in winter rape (Brassica napes L.). J. Plant Growth Regul, 1997,16, 47-53. 二 愈创木酚过氧化物酶（POD）活性的测定 -愈创木酚法【实验原理】在过氧化物酶催化下，H 2O2 将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在 470nm 处有最大光吸收，故可通过测 470nm 下吸光值变化测定过氧化物酶活性。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1. 分光光度计2. 台式离心机4（二）材料1. 磷酸氢二钠2. 磷酸二氢钠3. 2-甲氧基酚4. 30H 2O25. 陶瓷小研钵6. 2ml 离心管（三）试剂1. 0.2mol/L 磷酸缓冲液(pH6.0)：A 母液：0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液: 取 Na2HPO412H2O（分子量 358.14）71.7g；B 母液 ：0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取 NaH2PO42H2O（分子量 156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到 1000ml。0.2mol/L 磷酸缓冲液(pH6.0)的配制：分别取 A 母液(Na 2HPO4 )12.3ml 和 B 母液(NaH 2PO4 ) 87.7ml 混匀即为 100ml PBS(0.2M，pH6.0)；【实验步骤】1. 酶液提取 称取 0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入 1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液（pH7.8 ）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在 4、12000g 下离心 20min，上清夜即为酶粗提液。2. 酶活性测定（1）反应混合液的配制：取 50mlPBS（pH6.0，0.2M ）缓冲液于烧杯中，加入 28l 愈创木酚（2- 甲氧基酚）于磁力搅拌器上加热搅拌，直至溶解愈创木酚溶解，待溶液冷却后加入 19l30的 H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。（2）酶活性测定：取 3ml 反应液并加入 40l 酶液后测定 OD470 值在 40 秒的变化。以PBS 代替酶液为对照调零，3. 计算结果以每 min OD 值变化（升高）0.01 为 1 个酶活性单位（u） 。 ，按下式计算活性POD 活性= （A470Vt）/（WVs0.01t） (u/g FW)A470：为反应时间内吸光度的变化；W 为样品鲜重(g)；t 为反应时间(min)；Vt 为提取酶液总体积（ml） ；Vs 为测定时取用酶液体积（ml） 。【注意事项】1. 反应液配制时由于愈创木酚难溶，应加热一段时间。加入 H2O2 前注意溶液冷却，防止 H2O2 的挥发。2. 由于该反应迅速，加入酶液要立即进行吸光值的测定。5参考文献J.L. Muoz-Muoz, F. Garca-Molina, P.A. Garca-Ruiz, E. Arribas, J. Tudela, F. Garca-Cnovas, J.N. Rodrguez-Lpez, Enzymatic and chemical oxidation of trihydroxylated phenols, Food Chemistry, Volume 113, Issue 2, 15 March 2009, Pages 435-444F. Quintanilla-Guerrero, M.A. Duarte-Vzquez, B.E. Garca-Almendarez, R. Tinoco, R. Vazquez-Duhalt, C. Regalado, Polyethylene glycol improves phenol removal by immobilized turnip peroxidase,Bioresource Technology, Volume 99, Issue 18, December 2008, Pages 8605-8611三 CAT(过氧化氢酶)的测定【实验原理】过氧化氢酶(Catalase,CAT),是一种广泛存在于生物组织中的氧化还原酶，它能催化H2O2 分解为水和氧气,清除组织中的过氧化氢。 H2O2 在 240nm 处有一个吸收高峰,其吸光度与 H2O2 的含量成正比,过氧化氢酶能分解过氧化氢 ,使反应溶液吸光度 (A240)随反应时间而降低。单位时间内吸收的差值就是过氧化氢酶的活性。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1. 分光光度计2. 台式离心机（二）材料植物叶片等植物材料（三）试剂1 0.15mol/L 磷酸缓冲液（ pH7.0）： 取