研究生课程论文（作业）封面（ 2014 至 2015 学年度 第 1 学期）课 程 名 称： 兽医内科学专题 课 程 编 号： 206332学 生 姓 名： 学 号： 年 级： 2014 级任 课 教 师: 提 交 日 期：2014 年 11 月 25 日成 绩：_教 师 签 字：_开课-结课：第 1 周-第 18 周评 阅 日 期： 年 月 日东北农业大学研究生部制Nrf2-Keap1 抗氧化系统与肝脏疾病（东北农业大学 动物医学院，黑龙江 哈尔滨 150030）摘要氧化应激与肝脏疾病关系密切。Nrf2-Keap1 是细胞抵御氧化应激的一个重要调控系统，可诱导抗氧化酶及相解毒酶的表达，清除活性氧族，减轻细胞凋亡，本文对 Nrf2-Keap1抗氧化系统进行概述，探讨其与肝脏疾病的联系。关键词：Nrf2-Keap1；氧化应激；肝脏Nrf2-Keap1 Antioxidant System and Liver Disease（ College of veterinanry Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）AbstractOxidative stress and liver disease are closely related. Nrf2-Keap1 is an important regulatory system cells against oxidative stress, and can induce the expression of phase detoxifying enzymes, scavenging reactive oxygen species, reducing apoptosis, This article mainly reviewed Nrf2-Keap1 antioxidant system, discussing its links with liver disease.Key words: Nrf2-Keap1; oxidative stress; liver引言Nrf2 是一个由氧化应激介导的转录因子，伴随一系列下游目的基因以保护细胞。有研究表明 Nrf2-Keap1 抗氧化系统能增加肝脏抵抗氧化应激的能力 1。1 Nrf2 的概述Nrf2 首次从人类白血病细胞系（K562）的互补 DNA 文库中克隆出来，属于帽和领（Capn Collar，CNC）转录因子家族成员，是一个由 2.2kb 的碱基对编码的相对分子质量为 66000 的蛋白质。Nrf2 基因区域含有 6 个功能区，分别被命名为 Nehl-6，Keap1 是其特异性受体，正常情况下 Nrf2 作用被 Keapl 抑制，在氧化应激等情况下与 Keapl 解离被激活，Nehl 区中有一个亮氨酸拉链结构 bZIP，bZIP 与小 Maf 蛋白（small Mafproteins，包括MafG、MafK、MafF）形成异二聚体，识别抗氧化反应元件（ARE）上 DNA 基序（GCTGAGTCA）并与之结合，启动 ARE 调控的第相解毒酶及抗氧化酶基因表达，增加细胞对氧化应激和亲电子化学物质的抗性 2-6。2 Keap1 的概述Keap1 即 Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白 1，也被称作 INrf2。Keapl 最初描述在胞质中锚定于肌动蛋白，对 Nrf2 起着重要的负调节作用 。在生理状态下，Nrf2 的 N 末端上 Neh2结构与 Keap1 的 C 末端上 Kelch 重复区域结合，铆合在肌动蛋白细胞骨架上。Keap1 有三个主要的区，N 末端 BTB 区、一个连接片段（IVR）以及 C 末端肌动蛋白结合区（DGR） 。Keap1 的 N 末端，与其他 BTB 家族蛋白相似，是 Cullin 依赖性 E3 泛素连接酶的作用底物，可致使 Nrf2 泛素化并最终被 Cullin 依赖性 E3 泛素连接酶降解，所以 BTB 域是 Cul3/Rbx1诱导 Nrf2 降解时的中间接合物 7。Keap1 的 C 末端 DGR 区，对铆定 Nrf2 起重要作用 8。3 Nrf2 与 Keap1 的相互作用Keap1 在哺乳动物细胞中以同源二聚体形式存在，并以这种形式与一个单分子 Nrf2 结合。对于 Nrf2 与 Keap1 的结合，近来的研究提出了一个“铰链与门闩（hinge and latch） ”的相互作用理论。实验研究发现，Nrf2 上 Neh2 域中存在 2 个不同的 Keap1 结合位点，即保守的 29DLG31 和 79ETGE83 基序，其可与 Keap1 上 DGR 域中一个独立重叠的部位紧密结合，从而保证泛素的有效转移和 Nrf2 被蛋白酶体降解；在正常情况下，Keap1 与高亲和力的ETGE 基序结合后，可使 Nrf2 相对自由地移动，类似于“铰链”，而同时与低亲和力的 DLG域结合后，严格限制了 Nrf2 使其靶赖氨酸处于与泛素结合的最佳位置，类似于“门闩”；而在化学/氧化应激条件下，由于 Keap1 失去与 DLG 的“门闩”式结合，导致 Nrf2 泛素化受阻，且同时因 Nrf2 上靶赖氨酸的位置出现偏差， Nrf2 不再能被蛋白酶体降解，但可能由于ETGE 的 “铰链”式连接仍存在，致使 Keap1 与 Nrf2 的结合处于饱和状态，任何新合成的Nrf2 得以在细胞核蓄积，并激活细胞保护性基因，从而对细胞应激起解毒作用。3.1 Keap1 上的氨基酸残基大量研究数据表明，Keap1 上某些确定的半胱氨酸残基可能是诱导 Nrf2 和细胞保护性酶等亲电子化合物的靶标。靶标定点突变实验显示，Keap1 上 Cys-151、-273 和-288 对Keap1 功能发挥起至关重要的作用，这些半胱氨酸残基也可能就是 Nrf2 等亲电子诱导剂的靶标，其中，Cys-151 位于 Keap1 的 BTB 域，在化学或氧化应激条件下，可使 Nrf2 的抑制和泛素化减少，是诱导 Nrf2 从 Keap1 中释放的关键靶位，而 Cys-273 和-288 处于 Keap1上半胱氨酸丰富的插入区（IVR ） ，在生理条件下其抑制 Keap1 活性的作用十分必要，在Keap1 上 Cys-273 和-288 发生突变的细胞中，Nrf2 活化分子的反应性降低或消除 9。此外，新近的研究发现，Keap1 上还有其他靶位的作用也可将 Nrf2 从抑制中解除而激活。例如，Keap1 对 Nrf2 的抑制作用还依赖于其是否能形成二聚体，Keap1 上 104 位保守的丝氨酸残基（Ser-104）在二聚化过程中起重要作用，其突变将导致 Keap1 二聚体的解离和 Nrf2 的释放；而 Keap1 上 141 位酪氨酸（ Tyr-141）的磷酸化和脱磷酸化也能调节 Keap1 的稳定性和降解，Tyr-141 的磷酸化是 Keap1 维持稳定所必需的，Tyr-141 的脱磷酸化则会导致 Nrf2的释放。3.2 Nrf2 的磷酸化半胱氨酸残基的存在是 Nrf2 活化分子的一个共同特征，而磷酸化信号传导通路的激活也可能刺激 Nrf2 依赖性细胞防御，如可促进蛋白高度磷酸化的蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸在HepG2 细胞中能刺激 Nrf2 的核蓄积和 ARE 受体转基因的激活 10。许多研究显示，作为对Nrf2 功能的一个调节性影响，磷酸化过程可通过药理上抑制特异性蛋白激酶而起作用，这将减弱 Nrf2 被已知的活性分子的诱导；抑制一条蛋白激酶通路确实对多种细胞信号传导过程有显著影响，并可能影响 Nrf2 信号传导通路的完整性 11。而另有研究显示，蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC)、细胞外信号调节激酶（ extracellular signal-regulated kinase， ERK） 、 PKR 样内质网激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase， PERK） 、磷脂酰肌醇 3 激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K ）等的磷酸化作用会促进 Nrf2 和 Keap1 的解离 12。目前，研究得比较透彻的是，PKC 致使 Nrf2 上 Neh2 域的 Ser-40 磷酸化，能导致 Nrf2 与 Keap1 的解离；Nrf2 的翻译后修饰也会诱导激活 ARE13。但最近有实验研究表明，酪氨酸激酶 Fyn 致使 Nrf2 上 Tyr-568 磷酸化后，可使 Nrf2 从核中移出 14。因此，Nrf2 的磷酸化过程可能是其激活和失活的一个重要信号传导事件，可分别促进 Nrf2 的核蓄积和从细胞核中移出。4 Nrf2-Keap1 在肝损伤和肝病中的作用肝脏是机体的主要代谢器官。作为代谢的第一站，肝脏通常暴露在较高浓度的外源物和其他化学物质下，因此肝脏具备一系列抗氧化机制，能够清除自由基，维持体内自由基的代谢平衡。尽管如此，但是由于肝脏所处的位置与功能，它仍易受到中间活性物质引起的氧化损伤。氧化应激主要通过启动膜脂质过氧化来改变生物膜功能、与生物大分子共价结合及破坏机体内酶的活性等，在细胞因子（如 TNF-， NF-B）的共同作用下引起不同程度的肝损伤 15-16，这是动物健康的一个巨大困境。Nrf2-Keap1 抗氧化系统，调控抗氧化酶基因的转录活性，包括醌氧化还原酶（NADPH） ，谷胱甘肽 -S-转移酶（GST） 、谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCLC and GCLM） 、谷胱甘肽（GSH ）等。这些酶能够保护肝脏免受中间活性物质引起的氧化损伤 17-19。所以 Nrf2-Keap1 抗氧化系统涉及肝脏的各个领域，如调节肝脏的代谢、解毒及促进肝细胞再生，在肝损伤、脂肪肝、肝纤维化及肝癌等方面也具有保护作用。在肝脏代谢方面，运载体是肝脏对药物和环境化学毒物解毒的完整组件，Nrf2 可调控运载体的表达，肝脏的 Nrf2-Keap1 抗氧化系统通过相解毒酶和运载体调节代谢和转运过程来参与药物、胆固醇、糖的代谢及解毒。如 Nrf2 缺失小鼠使扑热息痛的葡萄糖酸化降低，导致 N-乙酰-对 -苯醌亚胺（NAPQ1）和肝毒性的增加，激活的 Nrf2 通过 Nqo1 及经由运载体多药耐药相关蛋白 3（Mrp3 ）增加对扑热息痛葡萄糖苷酸化代谢产物的排除来促进NAPQ1 的解毒 20。Nrf2 缺失小鼠能抵制胆结石的形成，Nrf2 在肝脏对胆固醇的摄取、代谢及排泄方面有一定的影响 21-22。在链唑霉素诱导的小鼠 1 型糖尿病中，Nrf2 缺陷小鼠肝脏糖异生葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸丙酮酸羧基激酶的 mRNA 增加并且糖酵解丙酮酸激酶的mRNA 减少，所以导致小鼠高血糖和尿排出量增加。楤木属根的乙醇抽提物对叔丁基-过氧化氢（t-BHP）所致的肝毒性的保护作用是经由 Nrf2 信号途径的抗氧化酶 HO-1。Nrf2 是肝癌的重要调节剂， Nrf2 调整的抗氧化酶及解毒酶的基因多态性与肝癌的发生密切相关。HBV 的慢性感染和饮食中摄入黄曲霉素可增加肝细胞癌的发生率，虽然乙型肝炎疫苗及减少食物储存过程中被黄曲霉素污染的措施已广泛采用，然而完全排除黄曲霉素污染是不可能的。所以用化学预防措施对黄曲霉素进行生理处理来降低肝细胞癌的发生率很关键。在上海，科学家正在研究饮用红茶以激活 Nrf2 的活性来预防黄曲霉素-B1 诱导的肝癌。对啮齿类动物及临床研究发现：Nrf2-Keap1-ARE 信号诱导物能增加细胞保护酶的表达，能有效地调节体内黄曲霉素的处理，有效地降低肝细胞癌