粗糙脉孢菌顺序四分子遗传分析摘要：了解粗糙脉孢菌的生活周期及特性；通过对粗糙脉孢菌的赖氨酸缺陷型和野生型杂交所得后代的表型分析，学习顺序四分子的遗传学分析方法，进行有关基因与着丝粒距离的计算和作图。关键词：粗糙脉孢菌；顺序四分子；交换型；非交换型；图距。Abstract: understand the life cycle and features of neurospora crassa; Through phenotype analysis to hybrid offspring of the neurospora crassa lysine defect type and wild type, Learning order four molecular genetic analysis method and related genes and centromere distance calculation and drawing.Key word: neurospora crassa. Fourth order; Exchange type; The exchange type; From figure.前言：粗糙脉孢霉(Neurosporocrassa)属于真菌中的子囊菌纲，是低等的真核生物。每一菌丝细胞中含有几十个细胞核。是遗传分析好材料: 1) 子囊孢子是单倍体，其表型直接反应其基因型。2) 一次只分析一个减数分裂的产物。 3) 体积小，易培养，繁殖快，一次杂交就能产生大量的后代，便于获得正确的统计学结果。4) 能进行有性生殖，其染色体的结构和功能类似于高等动植物。 5) 更加重要的是，子囊孢子在子囊中的线性排列顺序与减数分裂中期染色体在赤道板两侧的排列顺序相同，这就是粗糙脉孢霉成为了遗传分析的好材料。粗糙链孢霉的生活史:粗糙链孢霉有有性生殖和无性生殖。无性世代（单倍体世代）：菌丝体 分生孢子 菌丝体。粗糙脉孢菌生殖方式 有性世代（双倍体世代）：一个交配型的分生孢子落在另一交配型原子囊壳受精丝上，从而进入原子囊（子实体） ，进行多次有丝分裂，形 成多个单倍体核，这些单倍体核与子实体中的单倍体核融合，形成多个二倍体核，然后进入减数分裂，每个二倍体核形成 4 个单倍体核，再进行一次有丝分裂，形成 8 个核，最后形成为一个子囊中的 8 个子囊孢子。无性孢子分生孢子 有性孢子 子囊孢子实验原理：利用四分子分析法，测定基因与着粒间的距离称为着丝粒作图。着丝粒作图是基于这样的事实：减数分裂中在同源染色体的一对非姊妹染色单体的着丝粒和某杂合基因座间有没有发生交换，和其产物四分子中的等位基因在排列方式上是不同的。可分为两种：没有发生交换的产物为第一次分裂分离(first division segregation)或叫MI 模式;发生了交换的产物为第二次分裂分离(second division segregation)或称为MII 模式第一次分裂分离第二次分裂分离实验材料：1. 粗糙脉孢菌野生型菌株，Lys+，接合型 A，分生孢子呈粉红色。 2. 粗糙脉孢菌赖氨酸缺陷型菌株，Lys-，接合型 a，分生孢子呈白色。 器具和试剂： 显微镜、镊子、酒精灯、接种针、滤纸、载玻片、试管、培养皿、解剖针。 基本培养基、补充培养基、完全培养基、杂交培养基（以上培养基配方见本实验附录，供选用） 、5%次氯酸钠（NaClO） 、5%石炭酸。实验步骤：1.菌种活化：菌种平时在 45保存，使用前要先进行活化，以让菌种生长状态良好。只需将菌种分别接在完全培养基试管斜面上，28温箱培养 5 天左右，至菌丝的上部有分生孢子产生。有时，赖氨酸缺陷型在完全培养基上也长不好，需适量添加赖氨酸。2.杂交接种：将两亲本菌株接种在同一杂交培养基上。具体操作可采用下述方法。 （1）先接缺陷型，后接野生型，依次在杂交培养基上接种两亲本菌株的分生孢子或菌丝。然后在培养基上放入一灭菌的折叠滤纸，贴上标签，注明亲本及杂交日期。放入 25温箱进行混合培养。57 天后就能看到许多棕色原子囊果出现，随后逐渐发育成熟，变大变黑，约 14 天左右，就可在显微镜下观察。 （2）在杂交培养基上接种一个亲本菌株，25培养 57 天后即有原子囊果出现。同时准备好另一亲本菌株的分生孢子，用无菌水中配成近于白色的悬浊液，将此悬浊液加到形成原子囊果的培养表面，使表面基本湿润即可（每支试管约加 0.5ml） ，继续在 25培养。原子囊果在加进分生孢子 1 天后即可开始增大变黑成子囊果，7 天后即可成熟。3.压片观察：将试管中长有子囊果的滤纸片取出放入盛有 5%次氯酸钠的培养皿中。取一载玻片，用接种针挑出子囊果放在载玻片上（若附于子囊果上的分生孢子过多，可先在 5%次氯酸钠中洗涤，再移到载玻片上） ，用另一载玻片盖上，用手指压片，将子囊果压破，置显微镜低倍镜（1016）下观察，即可见一个果中会散出 3040 个子囊。象一串香蕉一样。可加一滴水或次氯酸钠，用解剖针把子囊拨开。此过程不需无菌操作，但要注意不能使子囊孢子散出，致使不能分辨子囊类型。观察过的载玻片，用过的镊子和解剖针等物都需放入 5%石炭酸中浸泡后取出洗净，以防止污染实验室。实验结果：子囊类型 孢子排列方式 分离类型 观察数合计1 - - - - 第一次分裂分离 11542 - - - - 11763 - - - 第二次分裂分离 2794 - - - 2655 - - - - 1866 - - - 194交换率：II12RF（着丝粒Lys +） 100 = =14.2%（ 279+265+186+194） 123254 MI+ II Lys+基因与着丝粒间的图距是 14.2cM.与教材 14.8 相差不大，X2 检验为 2.24由于 df=2-1=1,知在 0.50.1 间，差异不大，符合交换定律。讨论分析:粗糙脉孢菌的着丝粒Lys+实际距离大约为 14.8cM，实验测得结果为 14.2cM。造成这种差异的主要原因如下： 挑选出的子囊孢子观察时间不好。过早都未成熟，全为灰色；过迟都成熟了，全为黑色，因此无法准确分清各子囊类型。由于这种原因，在统计过程中，就会根据主管臆断来判断某些颜色接近的子囊孢子的排列顺序及类型，造成误差。 统计数目少。实验中虽然压片了 220 个子囊果，但是由于压片不到位，造成子囊未现显或是子囊已被破坏，无法清晰观察每个子囊果中的子囊类型，且每个子囊果中只能清晰统计到一至两个子囊，总的统计数目过少，对于需要大量统计数据的遗传学实验来说，产生了一定的误差。课后习题：1 小题和 2 小题报告中已写。3 粗糙脉孢菌子囊孢子的分离和交换现象，与高等动、植物的性状分离和基因交换有什么异同？答：一个与着丝粒交换，一个是两个基因间交换。参考文献：LIU Qing-Chang. Genetics. Beijing: Science Press, 2007, 99101. 刘庆昌. 遗传学. 北京: 科学出版社, 2007, 99101.