不同分类鉴定方法在益生菌菌株研究中的应用随着食品原料学和营养学的快速发展。食物的作用不再是简单的为机体生长提供基本原料。其对人类健康作用的研究内容也在不断地发生变化。冈此，功能性食品应运而生，且引起了世界科技工作者的极大关注。由于益生菌产品对人体机能有调节作用，因此成为功能性食品研究的焦点。1 益生菌的定义及生理功能1.1 定义益生菌(Probiotics)是指来源于宿主并对宿主健康有一定促进作用的活性微生物?。Probiotics 一词源于希腊文，意为“共生”，与 Antibiotics(抗生素)相对立。益生菌的概念是从 20 世纪初俄国著名科学家梅契尼柯夫提出的发酵乳制品有助于健康长寿的理论中发展而来的。1.2 生理功能人类对益生菌的研究大概有 100 a 左右的时间。目前，研究最多且被大量报道的益生菌主要是乳酸菌，包括双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳酸杆菌(Lactobacillus)和一些球菌等(LactococcusStreptococcus thermophilus)。益生菌进入人体肠道后，与肠内其他微生物菌群呈现栖生、偏生、竞争或吞噬等复杂关系，并达到促进宿主健康的目的。益生菌的主要生理功能有：1)排斥有害菌，调节肠道菌群平衡；2)缓鳃乳糖不耐症状；3)促进营养物质的吸收利用；4)调控胆同醇，抗击高血压；5)减轻过敏作用；6)抗衰老，具有美容功效；7)免疫激活，抗肿瘤。2 益生菌分类鉴定方法分类鉴定是微生物学中的一个重要领域。由于益生菌在食品、生物和医药工业中被作为种质资源长期应用，因此人们能够根据生长性状、代谢和发酵能力、存活率、作用靶位等特征，对其进行分类和鉴定。根据发展历史和方法的精确度。益生菌分类鉴定经历了不同的历史发展阶段。2.1 传统方法传统分类鉴定方法包含形态特征、生理生化反应、血清学反应等这些方法都基于微生物表面受体的特异性，属于表型分类法。2.1.1 形态结构和培养特征试验形态结构观察主要是利用显微镜对被染色的微生物形状、大小、排列方式、细胞结构及染色特性进行镜下直接观察，从而达到区别、鉴定微生物的目的。不同微生物在特定培养基中生长繁殖后所形成的菌落特征有很大差异。而在一定条件下同一种微生物的培养特征具有一定的稳定性，据此可以对不同微生物加以区别。2.1.2 生理生化试验微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。生化反应是指用化学反应测定微生物的代谢产物。从而鉴别一些在形态和其他方面不易区别的微生物。细菌生理生化试验包括过氧化氢酶测定、含碳化合物利用、糖或醇类发酵试验、淀粉水解试验等。GONZLEZ C J 等利用形态学和生理学特征从淡水鱼及其生活环境中分离了 249株益生菌并对其进行了鉴定。其中 92以上的分离株被鉴定到属的水平。WIJTZES T 等利用 2 种碳源发酵测试体系也未能将 14 种益生菌分离株鉴定到种的水平。虽然表型性状鉴定对部分益生菌是非常有用的，但对某些益生菌来说，即使表型性状很相似，也不意味着它们的基因型亲源关系很近。2.2 分子生物学鉴定方法鉴于表型鉴定的缺陷，经过不断努力，各国科学家逐渐采用分子生物学方法来开展益生菌分类鉴定在鉴定的准确性和效率方面均取得了长足的进步。2.2.1 DNADNA 分子杂交技术20 世纪 60 年代，DNADNA 杂交试验被用来分析菌株之间的亲缘关系，现其已成为细菌分类学研究的一个重要指标。核酸探针是一种经过标记、能与其互补序列杂交的单链核酸分子，其靶位是染色体上特定的序列，所选择的靶序列通常是某一属、种或菌株所特有的核酸序列，因此，只要将菌落裂解，使细胞内DNA 暴露，就可以直接采用探针与该菌落进行原位杂交。对探针采用同位素、酶或荧光素标记后，可以使其容易被检测。目前该方法已经被用来制备对双歧杆菌具有菌株或种特异性的核酸探针。Effie Apostolou 等人用荧光原位杂交的方法来鉴定人体肠道内 Lactobacidlus Fhamrto LGG。Efia Malinen等利用 DNA 探针来鉴定 Lhelveticus 的野生型及突变型，并获得了成功。2.2.2 recA 基因序列分析recA 基因负责编码 recA 蛋白质，后者在 DNA 重组、DNA 修复与 SOS 应急反应中具有至关重要的作用。研究表明，recA 基因的一个小片段有望成为一种灵敏性高、能用于种间进化发育亲缘研究的分子标记。Kullen 等首先将这种方法引入双歧杆菌属的研究。这种分子可以通过 PCR 技术从双歧杆菌典型菌株的肠道分析物中直接获得，引物是针对 recA 基因内特定区域的寡核苷酸，该区域在细菌内具有通用保守性。在该方法中形成的片段长度约为 300 kb。这种 recA 基冈有望成为一种对人体肠道双歧杆菌分离物进行比较性进化发育研究的有力工具。2.2.3 GC含量研究发现同种生物体内的 GC是固定的，但不同种生物的 GC会有很大的不同。测定 GC的方法很多其中最广泛和通用的方法是以化学法水解 DNA后再用电泳或 HPLC 来分析其中成分。在双链 DNA 中，A 与 T 配对、G 与 c 配对，因此，A 与 T 以及 G 与 C 的数量应相同。DNA 的 GC含量测定已广泛用于微生物鉴定中。在国外，Storck 首先测定了真菌 DNA 的 GC。并将 GC作为真菌分类鉴定参考标准之一。我国从 20 世纪 70 年代开始对细菌、真菌等微生物 DNA 的 GC进行测定，80 年代中期至 90 年代初又对衣原体、立克次氏体、蚤类等 DNA 的 GC进行了研究。2.2.4 基于 16S 或 23S rRNA 序列的 DNA 标记技术在益生菌进化过程中rRNA 分子的功能几乎保持不变，且分子中某些部位的排列顺序变化非常缓慢，因而得以保留古老祖先的一些序列。16S 或 23S rRNA 序列的 DNA 标记技术利用 PCR 的方法。采用针对 16S rRNA 基因两端通用保守区的引物直接对所分离到的菌株进行 16S rRNA 基因扩增，然后测定整个 PCR 复制子(约 1.5 kb)的序列组成，并与 rRNA 数据库进行比较。2.2.5 变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳(DGGE)是指利用一个梯度变性胶来分离 DNA 片段。由于不同DNA 片段的变眭条件不同，因此可在凝胶上形成不同的泳带。该技术的突出优点是可以分离具有细微差异的基因组片段，通过测序分析来揭示群落成员系统发育的从属关系，并能够同时检测多个样品，使对不同样品进行比较成为可能。2.3 编码和自动化鉴定系统编码鉴定方法是指根据鉴定对象采用一定数目的卡。所得结果以数字方式表达，并与数据库数据对照而得出鉴定结果。目前，已应用的快速、简便的商品化编码鉴定系统很多比较著名的有法国一梅埃里(BioMeneux)的 API 系统、Enterotube 系统、Spectruml0 系统等。国内也有少量的商品化编码鉴定系列。近年发展起来的益生菌自动化鉴定系统实现了从接种、培养、读数到报告的全过程自动化，技术较为成熟的是法国 Biomerieux ViteK Inc 生产的微生物鉴定仪(AMS)。2.4 荧光光谱法荧光光谱法(Fluorescence spectroscopy)又称荧光光谱法或荧光分析法，它利用物质所发射的荧光强度与浓度之间的线性关系进行定量分析，并以荧光光谱的形状和荧光峰对应的波长进行定性分析。AMMOR S 等利用乳酸菌样品内所含物质的 3 种激发光，即 250 nm(氨基酸+核酸)、316 am(NADH)和 380nm(NAD)，采用主成分分析法和因子判别式法进行数据分析分别在种、类、种类水平上对所收集到的乳酸菌样品进行分离鉴定。2.5 其他方法MARILLEY L 等利用基于电子鼻技术的质谱分析系统对乳酸菌的挥发性化合物进行评估，得到的分类鉴定结果与用分子生物学方法得到的结果相同。这种方法可用于区分样品中的细菌群落，发现新的能够产生气味的菌类；张斌等通过PCR 扩增 FtsZ 基因的一段 800bp 核苷酸，构建了干酪乳杆菌一片球菌及相关乳酸菌的 FtsZ 蛋白系统发育树。研究表明，FtsZ 蛋白序列的分辨率高于 16S rDNA，适用于乳酸菌种间的系统分类研究。3 展望利用包括形态特征法、生理生化反应特征法等传统方法对益生菌进行分类、鉴定时，存在耗时长、操作繁杂、准确度不高等问题。分子生物学技术尤其是PCR 技术、核酸测序技术和电泳技术的不断改进，以及生物信息学的蓬勃发展为益生菌的检测和鉴定指明了新方向打开了益生菌快速而准确鉴定的大门。虽然分子生物学技术用于益生菌分类鉴定中的研究时间较短，但它具有诸多优点，具有巨大的应用潜力。随着科学技术的不断发展、实验手段的持续改进、新兴分子生物学技术的出现和对快速检测试剂盒研制进程的加快益生菌的分类、鉴定工作一定会呈现出更加广阔的应用前景。农业科技与装备2010 年 7 月，第 7 期邵虎