1Tonight convenient? Our lab dinner is in the evening, we will punctually departure from the laboratory at five thirty聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法（常用）和光聚合法。PAGE 根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳：体系中缓冲液 pH 值及凝胶浓度相同；带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统：由于缓冲液离子成分、pH 、凝胶浓度及电位梯度的不连续性；带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率比连续系统电泳的较好。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由 AP 催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为 pH6.7 的 Tris-HC1。分离胶是由 AP 催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为 pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是 pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2 种孔径的凝胶、2 种缓冲体系、3 种 pH 值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH 值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。SDS-PAGE 各试剂作用1. 过硫酸铵（APS）为催化剂2. 四甲基乙二胺（TEMED） 为加速剂：在聚合过程中，TEMED 催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构3. SDS 是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。4. 强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和 SDS 后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS 结合成蛋白- SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。5. 聚丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液选择 trisHCL 系统；AP提供自由基；TEMED催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）阳离子去污剂，作用：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。6.7.8.9.10.1112.2 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在 SDSPAGE 不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是 TrisHCl 缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶 pH8.9；而电泳缓冲液使用的 Tris甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其 pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而 Cl 离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中 pH 的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH 对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素，当然其他的因素也可以从多方面考虑。 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原 SDS 处理、非还原 SDS 处理、带有烷基化作用的还原 SDS 处理。1）还原 SDS 处理：在上样 buffer 中加入 SDS 和 DTT（或 -巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成 SDS 与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样 Buffer，离心，沸水煮 5min，再离心加样。2）带有烷基化作用的还原 SDS 处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护 SH 基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的 DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul 样品缓冲液中 10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温 30min。3）非还原 SDS 处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用 1%SDS 沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 SDS-PAGE 电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择 pH6.8，分离胶选择 pH8.8，选择 TrisHCl 系统，TEMED与 AP：AP 催化剂，催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED 四甲基乙二胺，催凝剂，加速 AP 催化作用 ；十二烷基磺酸钠（SDS ）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 提高 SDS-PAGE 电泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或 4 度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致 SDS 结晶。一般凝胶可在室温下保存 4 天，SDS 可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技术手册P82-103。“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。 “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 为什么带出现拖尾现象？3主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。 为什么带出现纹理现象？主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。 什么是“鬼带”，如何处理？“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在 WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确 pH 值的 Buffer；降低分离胶的浓度。 为什么电泳的条带很粗？电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的 pH 正确(6.7 ） ；适当降低电压； 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？这种现象一般初学者易出现。比如电压 50v 以上，可电流却在 5mA 以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮） 。处理办法：电泳槽正确装配即可。 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？通常胶在 30MIN-1H 内凝。如果凝的太慢，可能是 TEMED，APS 剂量不够或者失效。APS 应该现配现用，TEMED 不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是 APS 和TEMED 用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。 电泳时间比正常要长？可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地 PH 选择错误，即缓冲系统地 PH 和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。分离胶加上后为什么要立即加水？加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。连续分离胶体系配制（凝胶板厚度 0.75mm，长度 10cm）100ml 体系：双蒸水 37.5ml尿 素 20-50g10TBE 缓冲液 8ml430%丙烯酰胺 10mlAPS（过硫酸铵）500-800ul 注：现配现用TEMED（四甲基乙二胺） 23.5ul