不同长效激活剂组分对沾 3 区块内源功能微生物激活研究 孙刚正 宋欣 吴晓玲 汪卫东 李希明 王增林 中石化胜利油田石油工程技术研究院 中石化胜利油田 摘 要： 以胜利油田沾 3 区块油藏内源微生物为激活对象, 筛选得到具有长效功能的激活剂组分, 并利用功能菌定量化检测技术, 研究了不同长效激活剂组分条件下产甲烷菌功能基因 mcr A、硝酸盐还原菌功能基因 nir S、硫酸盐还原菌功能基因 dsr A 这 3 种功能基因的增殖情况。研究发现, 经过实验筛选的长效激活剂组分, 在模拟油藏环境下, 相比较现用玉米浆配方均能较好地、长时间地激活内源微生物。含有植物多糖组分 (淀粉) 的激活剂体系厌氧产气效果显著, 气压最高可达到 0.064 MPa, 甲烷含量最高可达 1.44%, mcr A 基因随着时间的延长, 上升趋势明显。关键词： 微生物采油; 激活剂; 功能微生物; 功能基因; 产甲烷菌; 硝酸盐还原菌; 硫酸盐还原菌; 作者简介：孙刚正 (1980-) , 男, 博士, 副研究员, 研究方向:微生物采油。E-mail:sungangzheng.slytsinopec.com收稿日期：2016-08-17基金：国家高技术研究发展计划 (863 计划 2013AA064401) Study on Activation of Different Long-acting Activators on Endogenous Functional Microorganisms in Zhan 3 BlockSUN Gangzheng SONG Xin WU Xiaoling WANG Weidong LI Ximing WANG Zenglin Research Institute of Petroleum Engineering, Shengli Oilfield of SINOPEC; Shengli Oilfield, SINOPEC; Abstract： The composition of long-acting activator for the reservoir microorganism of Zhan 3 block in Shengli Oilfield was screened, and the proliferation of the functional microbe genes (mcr A nir S dsr A) of long-acting activators of different composition was studied by using the quantitative detection technology. It is found that, under the simulated reservoir condition, compared with the current activators which contain the dried corn steep liquor powder, the screened formulation of long-acting activator has better capacity to activate the endogenous microbes of the study area over a long period of time. The long-acting activator which contains the plant polysaccharides had the significant anaerobic gas-producing effect, the maximum gas pressure can reach to 0. 064 MPa, the methane content can reach to1. 44% and the rising trend of mcr A gene is remarkable with the extension of the cultured time.Keyword： microbial oil recovery; activator; functional bacteria; functional microbe gene; methanogens; nitrate reducing bacteria; sulfate reducing bacteria; Received： 2016-08-17孙刚正, 宋欣, 吴晓玲, 等.不同长效激活剂组分对沾 3 区块内源功能微生物激活研究J.西安石油大学学报 (自然科学版) , 2017, 32 (6) :112-118.SUN Gangzheng, SONG Xin, WU Xiaoling, et al.Study on activation of different long-acting activators on endogenous functional microorganisms in Zhan 3 blockJ.Journal of Xian Shiyou University (Natural Science Edition) , 2017, 32 (6) :112-118.引言微生物采油技术 (Microbial Enhanced Oil Recovery, MEOR) 是利用油藏微生物自身的有益活动及其代谢产物作用于油藏和油层流体以提高油田开采水平, 延长油田经济寿命的一项三次采油方法。油藏经过一段时间的注水开发会形成数量和结构上相对稳定的油藏微生物群落, 激活剂的加入可以快速激活油藏微生物, 改变其群落结构, 激活油藏中的驱油功能微生物, 形成相关的优势菌群1。前期的研究结果表明, 微生物采油技术是通过激活油藏近井地带的好氧微生物、油藏中部的兼性厌氧微生物和油藏深部的厌氧微生物这 3 方面共同作用来实现的, 油藏微生物的激活效果与激活剂的有效浓度密切相关, 而微生物的激活效果直接影响微生物驱油效果2-4。现用的常规激活剂体系以速效营养为主, 可以有效地、快速地激活油藏微生物, 因此, 近井地带会形成大量的微生物, 加上地层对营养组分的吸附, 造成常规激活剂体系在注入地层后被快速消耗, 到达油藏深部时常规激活剂浓度普遍较低, 无法为油藏深部的微生物提供充分的营养进行生长代谢5-6。因此需要研发长效激活剂体系, 为油藏中、深部微生物提供营养, 提高微生物驱油的整体效果。本文利用室内微生物培养实验和功能菌定量化检测技术, 初步筛选、设计不同的长效激活剂配方, 并在模拟油藏条件下, 比较激活前后甲基辅酶 M 还原酶基因 mcr A (产甲烷菌功能基因) 、亚硝酸盐还原酶基因 nir S (硝酸盐还原菌功能基因) 和亚硫酸盐还原酶基因 dsr A (硫酸盐还原菌功能基因) 的拷贝数, 分析功能微生物含量变化, 为微生物驱油技术的实施提供一定理论依据。1 实验材料与设备1.1 实验材料原油和地层水来自胜利油田沾 3 区块义南沾注入水和 X24 采油井, 密封后于4低温保存。化学原料:玉米浆干粉、棉籽糖蜜等 (天津化工经销部) , 植物多糖 (山东东营半球面粉厂) , 有机肥粉末、酵母粉等 (安琪酵母股份有限公司滨州分公司) , 磷酸氢二钾和硝酸钠等无机盐 (国产工业级) 。Premix PCR扩增体系、用于 PCR 片段连接转化的 p EASY-T3 Cloning Kit、Trans1-T1 感受态细胞 (全式金公司) , 氨苄、IPTG、x-Gal (Biodee 公司) , 引物合成由上海基康公司完成。1.2 实验设备光学显微镜 (日本 Nikon 公司) , 756MC 紫外可见光光度计 (上海菁华设备有限公司) , 电感耦合等离子体发射光谱仪 ICP-900 (N+M) (美国 Thermo 公司) , My Cycler 梯度 PCR 仪 (美国 Bio-Rad 公司) , 总有机碳测试仪 (德国耶拿公司) 。2 实验方法2.1 长效激活剂组分筛选根据油藏微生物激活剂组分的筛选标准及整个油藏微生物系统的营养需求, 所筛选的长效激活剂组分需要满足 3 个条件: (1) 油藏前端好氧微生物阶段尽量减少消耗; (2) 油藏深部厌氧微生物阶段快速激活; (3) 维持最高菌浓时间 5 d 以上。因此长效激活剂组分筛选实验分好氧培养 (三角瓶培养) 和厌氧培养 (厌氧培养瓶培养) 2 组。通过分析长效激活剂组分在 2 种条件下的激活菌浓, 判断所评价的长效激活剂组分对油藏微生物的激活速度、维持菌浓时间, 最终得到适合油藏条件的长效激活剂组分, 并对筛选得到的长效激活剂组分的碳、氮元素含量进行测定。2.2 长效激活剂组分激活规律研究将筛选得到的长效激活剂组分, 复配形成激活剂配方, 首先确定不同培养时间 (1 d、5 d、7 d、14 d、20 d、30 d、40 d、50 d、60 d、80 d 和 100 d) 的细菌浓度, 同时提取培养基中的菌群 DNA, 并利用油藏功能菌基因定量化检测技术对所筛选的长效激活剂配方激活前后功能微生物基因的变化进行评价7-8。菌浓通过显微镜细菌计数板进行检测, 菌体 DNA 的提取利用 Axy Prep 基因组提取试剂盒, 每次收集离心 10 m L 不同培养基中的菌体沉淀, 提取后的 DNA 利用nanodrop 进行浓度检测后保存在-70冰箱备用, 作为后期 3 种功能菌定量检测的模板。培养液采用 V (沾 3 注入水) V (沾 3X24 产出液) 为 11 混合而成, 培养液体积 150 m L。培养条件:沾 3 油藏温度 60, 兼性培养, 培养时间 100 d, 为保证气体压力测定的准确性, 瓶内环境温度达到 60后进行盖塞封蜡处理。取样时间分别为 1 d、5d、7 d、14 d、20 d、30 d、40 d、50 d、60 d、80 d、100 d。取样时需将厌氧瓶倒置, 以确保无空气进入。每组激活剂培养样品, 共做 3 个平行, 其中 1 个平行进行封口处理, 放置 100 d 后做气压、气组分测定, 1 个平行用于菌浓监测, 1 个平行用于不同时间培养液 DNA 提取。2.3 功能菌的荧光定量 PCR 检测利用提取的菌群 DNA 模板开展 mcr A、nir S 及 dsr A 3 种功能基因的的定量检测, 通过功能基因的变化揭示不同培养基作用下 3 类功能菌的动态变化, 并明确长效激活剂组分、激活时间与功能基因的对应关系9-11。3 种功能基因的荧光定量 PCR 扩增引物信息见表 112-13。通过实验构建每种功能基因的标准质粒并摸索实验条件构建标准曲线。荧光定量 PCR 采用 Bio-Rad 公司的 Sso Fast Eva Green Supermix, 反应体系为:mix, 10L;引物, 0.2L (1.5pmol) ;模板, 1L, dd H 2O 补齐到 20L。反应程序采用 2 步法, 94, 5 min;94, 30 s, 60, 1 min。表 1 3 类油藏功能菌功能基因扩增引物序列 Tab.1 Primers for specific gene of three kinds of functional bacteria in reservoirs 下载原表 3 结果与讨论3.1 长效激活剂组分筛选结果根据油藏微生物的激活剂组分的筛选原则, 分好氧组、厌氧组 2 批实验对初步筛选材料进行评价。从图 1 (a) 好氧组实验结果中可以看出, 现用激活剂体系主剂玉米浆是典型的好氧微生物所需营养, 菌浓在第 2 天就可达到峰值, 而植物多糖是 5 种营养组分中在好氧条件下激活较为平缓的组分