等离子体诱变微生物育种 李翔 太原理工大学继续教育学院 摘 要： 介绍了一种新型诱变育种技术等离子体诱变育种。首先对等离子体诱变的机理作了详细地阐述;其次分析了气体组分、气压、功率、气流速率和诱变时间五个影响等离子体诱变的主要外界因素;最后简单论述了在生物学领域中, 等离子体诱变取得的成果, 并展望其应用前景。关键词： 诱变; 等离子体; 活性氧自由基; 微生物育; 作者简介：李翔 (1971-) 女, 汉族, 山西代县人, 本科学历, 太原理工大学继续教育学院, 工程师, 从事教学管理工作。等离子体是除固态、液态和气态之外的第四种物质状态, 由大量的离子、电子以及中性粒子组成。等离子体是由于物质分子热运动相互碰撞使气体分子电离出自由电子, 电子在电场或磁场中加速形成高能电子, 进而碰撞气体分子使其电离, 往复循环, 最终形成大量中性粒子、离子和电子的混合物质。由于电离过程中正离子带的电荷和电子总是对应出现, 所以等离子体中正离子带的电荷数和电子的总数大致相等, 总体来看为电中性。反过来, 可以把等离子体定义为:正离子和电子的电荷密度大致相等的电离气体。等离子体根据其粒子的温度不同可分为高温等离子体和低温等离子体, 高温等离子体中所有粒子温度都处于较高的温度, 而低温等离子体中只有电子处于较高温度, 有较高的能量, 其他粒子则处于常温。根据其产生方式不同, 等离子体可分为微波等离子体、射频等离子体、介质阻挡放电等离子体、电晕等离子体、电弧等离子体等。等离子体诱变是在其灭菌原理基础上, 近几年才起步发展的一种诱变方法。在诱变育种的应用中, 由于生物的热敏性只能采用冷等离子体诱变, 该方法既弥补了化学方法的高污染性和变异单一性, 解决了传统物理诱变法的遗传不稳定、变异率低等缺点。与近些年兴起的离子注入诱变法相比, 等离子体诱变技术对真空的要求不高, 不会因真空产生的低温或由离子束产生的高温而使细胞失活, 该诱变技术可以较大程度的提高细胞存活率, 提高诱变效率, 是一种适合于微生物诱变育种的技术。1 等离子体诱变原理微生物的变异是指外界因素使细胞内的 DNA 分子被破坏, 使其大量的碱基配对错误, 从而导致在 DNA 复制时产生基因突变, 子代出现不同的基因型和表现型。冷等离子体中富含各种射线和粒子, 等离子体诱变技术是通过对细胞有影响的光、荷电粒子和中性粒子等离子体对生物表层及遗传物质造成损伤、引发细胞修复, 从而导致生物体表型和基因的改变。在等离子体诱变中, 射线和粒子对细胞表层造成的直接刻蚀作用。电子、自由基等对细胞壁造成直接损伤, 改变细胞膜的通透性, 从而使各种诱变因子易于进入细胞而与 DNA 发生作用。电子具有较高的能量, 但其能量碰到分子易损失, 只能作用于细胞表层与细胞壁上的大分子, 使其在一定程度上受损。各种活性氧自由基与细胞壁的大分子产生复杂的化学效应和生物效应, 也会对细胞壁和细胞膜的结构造成损伤。研究人员发现等离子体处理过的微生物胞内蛋白和核酸浓度减少, 而胞外溶液中蛋白和核酸浓度增加, 这表明等离子体可以破坏细胞壁和细胞膜结构, 对细胞表层造成直接刻蚀, 这样紫外线及各种粒子可以很容易地进入细胞与胞内物质反应。当细胞的表层遭到破坏以后, 进入细胞的各种诱变因子与细胞中的 DNA 产生作用。冷等离子体对微生物 DNA 产生伤害及诱变效应的可能原因有三种: (1) 是紫外线直接照射 DNA 引起基因突变。对 DNA 有明显伤害作用的紫外线波段是200-280nm, 而等离子体中此波段的紫外线剂量不足, 难以对 DNA 造成较大的伤害。 (2) 是原子通过紫外线照射与微生物 DNA 分子结合形成不稳定化合物, 造成微生物变异。在充入惰性气体的等离子体中, 原子在紫外照射下也难以与其他物质反应, 也不会对 DNA 造成损伤, 但会产生自由基, 通过自由基对 DNA 分子造成损伤。 (3) 是活性氧自由基与微生物 DNA 分子产生氧化反应, 造成微生物变异。Mathieu Leduc 等将裸露的 DNA 分别由充氦气的介质阻挡放电等离子体和大气压辉光等离子体炬处理后均会得到断裂的 DNA 片段, 并证实了活性氧自由基是造成 DNA 断裂的主要因素。因此活性氧自由基是等离子体诱变的主导因素。诱变过程中, 活性氧自由基进入细胞后, 首先与 DNA 分子中的碱基或脱氧核糖发生反应生成其它自由基, 如胸腺嘧啶经过氧化, 生成胸腺嘧啶二羟基醇, 鸟嘌呤被氧化后生成 8-氧桥鸟嘌呤;导致 DNA 碱基被破坏, 当细胞中 DNA 分子中高密度长片段发生损伤, 会导致 DNA 复制过程受到抑制, 激发细胞的修复机制, 即 SOS 修复, 在 DNA 分子的复制受到抑制时, 会产生一种具有较低特异性的聚合酶、重组酶等。这些酶可催化损伤部位的 DNA 复制, 使细胞得以存活, 在DNA 复制时导致碱基的错配、DNA 链断裂, 进而导致染色体重复、倒位、易位或缺失, 使遗传性质发生较大变化, 进而易引发广泛、长期的突变, 形成新的表现型和基因型。2 影响等离子体诱变的因素影响等离子体诱变的因素可以分为两类:一是等离子体产生的条件, 包括气体气压、气流速率、组分或功率等) ;二是诱变操作的条件 (如诱变时间) 。等离子体中通入气体的组分对等离子体产生自由基的种类影响很大, 不同的气体组分会产生不同的反应, 形成不同的自由基, 如通入氢气会产生氢自由基, 氧气会产生氧自由基, 水蒸气会产生羟基自由基。Xianhui Zhang 等在研究大气压介质阻挡放电等离子体对链球菌的作用时发现通入氦气和少量氧气时产生氦、羟基和氧三种自由基, 实验证明使链球菌失活的主要是羟基和氧自由基。由此可证明, 氧气在等离子体中产生活性氧自由基, 这种活性氧自由基对细胞的破坏作用是至关重要的。研究表明不同自由基的氧化性不同, 对微生物的诱变效果也不同, 如羟基自由基对大肠杆菌造成的伤害很小, 而氧自由基和一氧化氮自由基对大肠杆菌造成的伤害较大, 一氧化二氮自由基和过氧化物自由基对大肠杆菌造成的伤害更为明显。即使同种自由基对于不同的微生物造成的伤害也有差异, 羟基自由基对于大肠杆菌造成的伤害很小, 而对链球菌造成的伤害很大。因此, 某种或几种能在等离子体中产生多种活性氧自由基的气体组分对等离子体诱变起着积极的作用, 选取气体组分时也应考虑对特定微生物的针对性。气压对等离子体诱变过程中细胞的存活率有一定影响, 也会对活性氧自由基的浓度产生影响。可用于诱变的等离子体有低压等离子体和大气压等离子体, 一般气体压力低于 1103Pa 的为低压等离子体, 主要用于辉光等离子体。由于低压会造成细胞在未诱变之前死亡, 也会降低等离子体产生自由基的浓度, 从而影响诱变效果, 因此现在大部分诱变利用大气压等离子体实现。然而低压会使等离子体中电子的自由程增加, 可能会产生氧化性更强的自由基, 对诱变产生一定的正面影响。因此气压对诱变效果的影响还需要进一步的验证。等离子体的功率对诱变的影响是间接的, 功率是通过电子的能量和自由基的氧化性来使细胞变异的, 功率的大小会直接影响电子的能量大小及活性氧自由基的形成, 从能量的传递方面来讲, 功率越大对细胞的破坏就越强。Bo Yang 等在研究大气压冷等离子体灭菌时, 功率越高细菌存活率越低, 功率达到 15W 时, 只需处理 9s, 细菌死亡率就达 100%。对于诱变来说, 需要找到一个合适的诱变功率, 使致死率和正突变率均达到最佳的水平。气体的流速对于诱变的影响在于它能控制等离子体的形态和自由基的密度, 而等离子体发光影像的形状与其各部分的自由基密度有关。等离子体刚产生时离子化不稳定, 这会导致电荷收缩到电极表面, 引起局部温度升高, 高温会导致离子化程度更高, 使整体的离子化程度不均一, 而气体的流动会带走多余的热量使离子化稳定。气体流速过高又会带走大量自由基, 使活性氧自由基密度减小。J Goree 等发现, 等离子体发光影像在气体低流速时为实心圆形, 高流速时为环形, 与高能电子的空间分布有关, 发现气体流速决定了自由基产生的位置。诱变时间对等离子体诱变的影响非常明显, 一般诱变时间越长, 细胞的存活率就越低, 夏书琴等利用大气压辉光放电冷等离子体对链霉菌孢子进行诱变时, 得到菌体致死率随时间的延长而逐渐增加, 到 6min 时达 100%。而董晓宇等人通过大气压冷等离子介质阻挡放电法, 对产 1, 3-丙二醇的克雷伯氏菌诱变, 制得随诱变时间增加细胞存活率下降的曲线, 但细胞存活率下降到一定值会饱和, 细胞自我修复机制的激活会导致存活率有所上升。由于诱变装置和诱变菌种的差异, 以上两者的致死率随时间变化的曲线稍有不同, 然而其总体趋势是一致的。以上五种诱变因素都会不同程度地影响诱变效果, 其中诱变时间和气体组分有较系统的报道, 而其他三种因素没有系统的研究报道, 气压对诱变影响的有关文献资料尤其少, 因此这些有待于进一步研究。等离子体诱变的装置有多种, 它们对于同种微生物诱变特点的比较也有待于进一步研究。3 等离子体在生物领域的应用前景等离子体在生物领域有着一定程度的应用。近几年, 等离子体诱变技术虽取得了阶段性成果, 得到了快速发展, 但应用并不广泛。Yuan Lu 等人利用大气压室温等离子体诱变, 制得突变体, 其产氢量约 1.134molH2/mol 葡萄糖, 是原菌株的 126.4%倍。夏书琴等人也利用大气压辉光放电冷等离子体, 对茂源链轮丝菌 03-10 进行诱变, 制得高产谷氨酰胺转氨酶的突变株 G2-1, 酶活高达到2.73U/mL, 是出发菌株的 182%倍, 具有较稳定的遗传性。Xiufu Hua 等人利用大气压常温辉光等离子体对肠杆菌进行诱变, 制得耐盐性肠杆菌 (MU-1) , 其耐盐性高达 7.5%, 是野生菌种的三倍多。董晓宇等人亦采用大气压冷等离子介质阻挡放电法对产 1, 3-丙二醇的克雷伯氏菌进行诱变, 制得突变株, 其对甘油的质量转化率高达 0.57g/g, 是野生菌株的 158%倍。等离子体诱变技术应用用育种领域, 相比于传统技术, 具有效率高, 操作简单, 绿色环保等优点, 但是作为一种创新性诱变方法, 技术方面仍需探索, 逐步完善, 逐步成为可以得到广泛应用的诱变育种方法。参考文献1菅井秀郎.等离子体电子工程学M.北京:科学出版社, OHM 社, 2002. 2Mathieu Leduc et al.Effects of non-thermal plasmas on DNA and mammalian cellsJ.Plasma Process.Polym, 2010, (7) :899-909. 3夏书琴等.大气压辉光放电低温等离子体诱变选育谷氨酰胺转胺酶高产菌株J.微生物学通报, 2010, 37 (11) :1642-1649.