高效液相色谱法测定共轭亚油酸甘油酯 刘珍珠 张辉珍 孙云飞 邱阿敏 梁小芳 王晓滨 青岛大学公共卫生学院 青岛市食品药品检验研究院 青岛澳海生物有限公司 作者简介：张辉珍 13963988819163.com基金：青岛市民生科技计划项目 (14-2-3-74-jh) 共轭亚油酸甘油酯产品是以红花籽油为原料, 通过共轭化反应将其中的亚油酸转化成共轭亚油酸1-2, 然后与甘油进行酯化反应, 生成共轭亚油酸甘油酯3-4。卫生部 2009 年第 12 号公告批准其作为新资源食品, 可以直接服用或者添加到脂肪、食用油和乳化脂肪制品中。目前, 国内外对共轭亚油酸甘油酯的研究大多集中在制备、萃取和合成方面5。而共轭亚油酸甘油酯的检测方法一直是制约其生产工艺和产品质量的一个难题, 目前国内外没有共轭亚油酸甘油酯的检测方法标准。脂肪酸甘油酯的测定方法有薄层层析法 (TLC) 6-8、气相色谱法 (GC) 9-11、高温气相色谱 (HTGC) 直接进样法9-10和高效液相色谱法 (HPLC) 12-14。TLC 精度不高, GC 无法确定脂肪酸的酯型, HTGC 的灵敏度低、重现性差。用 HPLC 测定时, 由于脂肪酸甘油酯的紫外吸收是羧基的末端吸收, 吸收强度很弱, 紫外检测器灵敏度低15;用示差折光检测器 (RID) 检测时, 由于 RID 对流动相的稳定性要求苛刻, 无法用梯度洗脱, 不适合用于极性差别大的甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯的检测。有报道利用 HPLC 在 233nm 处测定牛奶脂肪中共轭亚油酸甘油酯的含量16-17, 但由于没有商品化的共轭亚油酸甘油酯的标准品, 对其定量只能用归一化法, 而不同共轭亚油酸酯型的紫外吸收强度有很大差别, 归一化法定量的结果误差很大。文献18-19报道了采用 HPLC-蒸法光散射检测器 (ELSD) 测定了单脂、二酯和三脂化合物, 但国内对共轭亚油酸甘油酯的测定未见报道。本工作采用反相高效液相色谱梯度分离, ELSD 检测, 通过优化流动相和检测器参数, 使共轭亚油酸甘油三酯、二酯和一酯得到很好的分离和测定。1 试验部分1.1 仪器与试剂Agilent 1200 型高效液相色谱仪, 配 ELSD。单标准储备溶液:10.00gL, 分别称取亚油酸甘油三酯、1, 3-亚油酸甘油二酯、1, 2-亚油酸甘油二酯和 1-亚油酸甘油一酯对照品各 0.100 0g 于 10mL 容量瓶中, 用正己烷-异丙醇 (9+1) 溶液溶解并定容。混合标准溶液:移取亚油酸甘油三酯标准储备溶液 3.00mL、1, 3-亚油酸甘油二酯标准储备溶液 0.40 mL、1, 2-亚油酸甘油二酯标准储备溶液 0.30mL、1-亚油酸甘油一酯标准储备溶液 0.10mL 于 10 mL 容量瓶中, 用正己烷-异丙醇 (9+1) 溶液稀释并定容, 此溶液中亚油酸甘油三酯、1, 3-亚油酸甘油二酯、1, 2-亚油酸甘油二酯、1-亚油酸甘油一酯的质量浓度分别为 3.00, 0.40, 0.30, 0.10gL。亚油酸三甘酯、1, 3-亚油酸二甘酯、1, 2-亚油酸二甘酯、1-亚油酸一甘酯对照品, 纯度不小于 99.0%。正己烷、异丙醇、乙酸乙酯、甲酸均为色谱纯。1.2 仪器工作条件ZORBAX RX-SIL 色谱柱 (4.6mm150mm, 5m) ;流动相 A 为正己烷, 流动相 B为正己烷-异丙醇-乙酸乙酯-甲酸 (80+10+10+0.1) 混合液;流量 1mLmin;进样量 10L。梯度洗脱程序:02min 时, A 为 98%;28min 时, A 由 98%降为65%;88.5min 时, A 由 65%降为 2%;8.515min 时, A 保持为 2%;1515.1 min 时, A 由 2%升至 98%;15.119 min 时, A 保持为 98%。氮气流量 1.5mLmin;漂移管温度 40。1.3 试验方法称取样品 0.100 0g 置于 100mL 容量瓶中, 用正己烷-异丙醇 (9+1) 溶液溶解并定容, 充分混匀后, 在仪器工作条件下进行测定。2 结果与讨论2.1 色谱行为在仪器工作条件下, 混合标准溶液和样品溶液的色谱图见图 1。图 1 色谱图 Fig.1 Chromatograms 下载原图1-亚油酸甘油三酯;2-1, 3-亚油酸甘油二酯;3-1, 2-亚油酸甘油二酯;4-1-亚油酸甘油一酯2.2 流动相的选择甘油酯的极性较弱, 易溶于正己烷等非极性溶剂, 在甲醇等极性溶剂中溶解度小, 所以试验选用非极性的硅胶柱分离。甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯的极性相差较大, 甘油三酯由于没有暴露的羟基, 所以极性最弱, 在正相色谱分离中最先流出。甘油一酯有两个未结合的羟基, 所以有一定的极性, 在正己烷中的溶解度低, 流动相中正己烷体积分数高于 95%时出峰时间很晚。在等度洗脱条件下, 无法很好地分离样品中存在的甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯。试验选用正己烷作为流动相之一, 通过梯度添加不同比例的异丙醇、乙酸乙酯、甲酸来调节流动相的极性, 使甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯得到有效分离, 梯度洗脱条件见 1.2 节。2.3 检测器参数的选择漂移管温度和载气流量是 ELSD 的两个重要参数。漂移管的温度会影响到雾化时溶质颗粒的大小、均匀程度, 进而影响测定结果的准确性。试验将漂移管的温度分别设为 70, 60, 50, 40, 结果表明, 当漂移管的温度为 40时, 响应值最大且噪声较小、基线平稳。载气流量大小决定基线稳定性和响应值, 在一定范围内, 载气流量越大, 基线越平稳但响应值越小。试验从 2.0mLmin 逐渐降低载气流量, 发现载气流量为 1.5 mLmin 时, 基线稳定, 信噪比最佳。2.4 样品溶剂的选择共轭亚油酸甘油三酯易溶于石油醚、正己烷等非极性有机溶剂, 不溶于水和冰乙醇;共轭亚油酸甘油二酯比甘油三酯的极性大;甘油一酯有两个游离的羟基, 极性最大, 在非极性的正己烷中溶解性不好, 正己烷中添加少量的异丙醇会大大增加甘油一酯的溶解度。试验发现, 在正己烷-异丙醇 (9+1) 溶液, 样品的溶解性很好, 溶液澄清透明。因此, 试验选择正己烷-异丙醇 (9+1) 溶液为样品溶剂。2.5 标准曲线与检出限分别移取混合标准溶液 50, 100, 150, 200, 300, 400L, 用正己烷-异丙醇 (9+1) 溶液定容至 1mL, 进样分析, 以各物质的质量浓度的对数为横坐标, 峰面积的对数为纵坐标绘制标准曲线, 各物质的线性范围、线性回归方程和相关系数见表 1。按 3 倍信噪比计算检出限, 10 倍信噪比计算测定下限, 结果见表 1。2.6 样品分析按试验方法测定共轭亚油酸甘油酯中的亚油酸甘油三酯、1, 3-亚油酸甘油二酯、1, 2-亚油酸甘油二酯和 1-亚油酸甘油一酯, 平行测定 6 次, 计算测定值的相对标准偏差 (RSD) , 结果见表 2。本工作建立了测定共轭亚油酸甘油酯中甘油三酯、甘油二脂、甘油一酯的高效液相色谱-蒸发光散射检测法。方法精密度高、灵敏度高, 适合对共轭亚油酸甘油酯产品进行快速分析, 对共轭亚油酸甘油酯的生产和产品质量控制具有指导意义。表 1 线性参数和检出限 Tab.1 Linearity parameters and detection limits 下载原表 表 2 样品分析结果 (n=6) Tab.2 Analytical results of sample (n=6) 下载原表 参考文献1海丽娜, 陈业高, 廖心荣.不同产地红花籽油中的脂肪酸的比较J.云南师范大学学报 (自然科学版) , 2004, 24 (1) :53-54. 2蒲旭峰, 胡文清.气相色谱法测定红花籽油中亚油酸的含量J.华西药学杂志, 2001, 16 (6) :371-372. 3衣丹, 刘发义, 姜伟, 等.无溶剂体系酶催化酯化反应合成共轭亚油酸油脂的研究J.中国粮油学报, 2005, 20 (2) :61-63. 4彭永健, 许新德, 张莉华, 等.红花籽油制备共轭亚油酸工艺优化及其组成分析J.中国油脂, 2015, 40 (6) :72-76. 5田玉霞, 苗榕宸, 杨丹白, 等.共轭亚油酸甘油酯的研究进展J.中国油脂, 2015, 40 (6) :32-35. 6AET I, SCHAROUN J E, RALSTON H.Quantitative estimation of isomeric monoglycerides by thin-layer chromatographyJ.Journal of the American Oil ChemistsSociety, 1965, 42 (9) :789-792. 7PRIVETT O S, BLANK M L.Charring conditions for the quantitative analysis of mono-, di-, and triglycerides by thin-layer chromatographyJ.Journal of the American Oil ChemistsSociety, 1962, 39 (12) :520-520. 8FONTANA J D, ZAGONEL G, VECHIATTO W W, et al.Simple TLC-screening of acylglycerol levels in biodiesel as an alternative to GC determinationJ.Journal of Chromatographic Science, 2009, 47 (9) :844-846. 9李长秀, 唐忠, 杨海鹰.气相色谱法测定生物柴油样品中脂肪酸甲酯和脂肪酸甘油酯的含量J.分析测试学报, 2005, 24 (5) :66-68. 10王丽丽, 汪勇, 胡长鹰, 等.高温气相色谱分析甘油酯的研究J.中国油脂, 2011, 36 (7) :75-79. 11CHRISTINA P, EBERHARD L.Simultaneous determination of glycerol, and mono-, di-and triglycerides in vegetable oil methyl esters by capillary gas chromatographyJ.Journal of Chromatography A, 1995, 697 (1) :461-468. 12靳林溪, 谢建春, 王石, 等.RP-HPLC-APCIMS 和 RPHPLC-ELSD 法分析鸡脂甘油酯组成及结构J.食品科学, 2012, 33 (18) :149-155. 13钟南京, 李琳, 李冰, 等.甘油酯的液相色谱分析J.现代食品科技, 2012, 28 (1) :123-126. 14ISO 18395:2005 (E) Animal and vegetable fats and oils-Determination of monoacylglycerols, diacylglycerols, triacylglycerols and glycerol by high-performance size-exclusion chromatography (HPSEC) S. 15方敏, 赵谋明, 赵强忠.三种 HPLC 检测器测定单甘酯含量的方法比较J.食品科学, 2013, 34 (8) :161-163. 16ADLOF R O, MENZEL A, DOROVSKA-TARAN V.Analysis of