实验教学教案首页本次实验项目：实验二醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白本次实验课时：5 学时教学要求： 1掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。2学会使用 38B 型电泳槽及点样技术。重 点：滤纸桥的制做、薄膜的处理、点样难点：点样教学手段及教具：课堂讲授，学生实验操作。讲授内容及时间分配：课堂讲授1相关知识 0.1 学时2实验目的 0.1 学时3实验原理 0.3 学时4实验操作 0.2 学时实验教学醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白 4 学时参考资料 生物化学实验醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白（验证性）相关知识血清蛋白：血清中含有多种蛋白质，它们之中有的和某些糖类结合，形成糖蛋白。人血清中蛋白质的等电点及相对分子质量蛋白质名称 等电点（pI） 相对分子质量/Mr白蛋白 1球蛋白 2球蛋白球蛋白球蛋白4.85.065.065.126.857.56900020000030000090000150000156000300000醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强（厚度 120 微米） ，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，可以很好的消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，具有用样量少（5g 的蛋白质可得到满意的分离效果） ，分离清晰，无吸附作用。醋酸纤维素薄膜经 1,4二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。氨基黑：是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常用的蛋白质染料。带有负电荷的磺酸基，能与蛋白分子上带正电荷的侧链相结合。氨基黑分子含有较多的亲水基团，和蛋白质亲水微区有很大的亲和力。因此，以凝胶基质作为电泳支持物时由于亲水的凝胶基质与氨基黑有很大的亲和力，不容易漂洗，一般不使用它进行染色。根据电荷不同的纯化方法之一 电泳血液：分为血细胞和血浆血细胞：包括 红细胞 白细胞 血小板（凝血）血浆：是不含血细胞的。血浆中溶解着血纤蛋白原，它可转变成不溶性的血纤蛋白。血清：是不含血纤蛋白原的血浆临床意义急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭时，清蛋白降低，1、2 和 -球蛋白升高；慢性活动性肝炎、肝硬化时，清蛋白降低，、-球蛋白升高；急性炎症时，1、2-球蛋白升高；慢性炎症时，清蛋白降低，2、-球蛋白升高；红斑狼疮、类风湿关节炎时，清蛋白降低，-球蛋白显著升高；多发性骨髓瘤时，清蛋白降低，-球蛋白升高，于 和 -球蛋白区带之间出现“M”带。一、实验目的掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。二、实验原理蛋白质是两性电解质，在 pH 小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在 pH 大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基不同，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在同一 pH 的溶液中，所带净电荷也不同，因此，在电场1,4-氨基-5-羟基-3-(对硝基苯偶氮)-6-(苯偶氮)-2,7-萘二磺酸二钠盐 1,4-氨基-5- 羟基-3-(对硝基苯偶氮)-6-(苯偶氮)-2,7-萘二磺酸二钠盐中迁移速度不同。在同一 pH 的溶液中，所带净电荷不同，因此在电场中移动速度不同，故可利用电泳法将它们分离。正常人血清在 pH8.6 的缓冲体系中电泳 1h 左右，染色后可显示五条区带。该方法目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、同工酶、多肽、核酸及其它生物大分子。具有操作简单、快速、廉价的特点。三、实验仪器、材料与试剂（一）实验仪器DYY- 型电泳仪、 38B 型电泳槽、染色和脱色装置（自制） 、血色素点样器（自制） 、单面刀片、镊子、吹风机、普通滤纸、醋酸纤维素薄膜（2cm8cm） 。（二）材料新鲜人血清（三）试剂1 巴比妥巴比妥钠缓冲液：（pH8.6,0.07mol/L，离子强度 0.06） ；称取 1.66g 巴比妥（A.R）和 12.76g 巴比妥钠(A.R)，置于三角烧瓶中，加蒸馏水约 600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至 1000 ml，置 4保存备用.2血清蛋白染色液: 称取 0.5g 氨基黑 10B，加蒸馏水 40ml，甲醇(A.R)50 ml，冰乙酸(A.R)10 ml，混匀溶解后置具塞试剂瓶内贮存。3漂洗液：取 95%乙醇(A.R)45 ml，冰乙酸(A.R) 5 ml，和蒸馏水 50 ml，混匀置具塞试剂瓶贮存。4透明液：透明液甲：取冰醋酸(A.R)15 ml，无水乙醇(A.R)85 ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用； 透明液乙： 取冰醋酸(A.R)25 ml， 无水乙醇(A.R)75 ml， 混匀置试剂瓶内,塞紧瓶塞，备用。四、实验操作步骤1薄膜的准备置于盛有缓冲液的平皿中，浸泡 30 分钟方可用于点样。取出膜片并用滤纸吸去多余的缓冲液，不可吸得过干。2电泳槽的准备在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，制做滤纸桥使滤纸的一端能紧贴在膜支架上，滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维薄膜的桥梁。3点样 无光泽面向上，用毛细管吸取血清，均匀涂在加样器上，再轻轻印在加样线上（在无光泽面距短边一端 1.5 cm 处） ，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线。 4电泳用镊子将薄膜加样端平贴在电泳槽阴极端滤纸桥上且薄膜点样面朝下（光滑面朝上） ，中间不能下垂，盖上电泳槽盖，使薄膜平衡 10min。点样端接负极，打开电源开关，调节到每厘米膜宽度电流 0.5 mA, 电泳 5080 min,，注意看前沿。电泳完毕,调节电流到零,关闭电泳仪,切断电源。5染色与漂洗脱色用镊子取出电泳后的薄膜,放在含 0.5%氨基黑 10B 染色液中,浸染 10 min,取出后先过水再放入漂洗液浸洗脱色,每隔 10 min 换漂洗液 1 次,至背景蓝色脱尽。取出薄膜放在滤纸上。6透明将脱色后的薄膜完全凉干年，浸入透明液中 35 min，取出后立即紧贴于干净玻璃烧杯面上，不能有气泡。约 2 min 薄膜透明，垂直放置待其自然干燥五、实验结果与讨论1 将薄膜贴在实验报告纸上，注名条带蛋白名称2 对电泳区带结果进行分析解释讨论。六、注意事项