食用菌菌种制作技术能否制做出合格菌种? 是评价食药用菌生产专业户是否“专业”的标准。更为重要的是自繁菌种可以大大降低买种的费用，进而提高经济效益。食药用菌菌种来源一般有两种途径：一是采用组织或孢子分离技术自繁，二是从有关科研部门引种。一、菌种分离食药用菌菌种的分离有 2 种方法：组织分离和孢子分离。这些方法一般由科研单位采用，所分离的菌种须经出菇品比试验，成功后才能推广应用。 组织分离 这种方法属于无性繁殖或克隆技术，从理论上讲，所获菌种不发生遗传重组等变异，因此常被生产上采用。选择无污染并菇形健壮的食药用菌幼菇(6 分成熟)，采摘后及时放入灭过菌的纸袋中带回接种室，连同母种用试管培养基等用品一起放入接种箱内消毒。在接种箱内无菌操作，先用 75%的酒精消毒双手和工具，然后用 0.1%升汞液消毒种菇表面，用消过毒的解剖刀从菌盖与菌柄联结处的中部纵切开，在菌盖与菌柄交界处切成长条形小块，用接种钩钩取小块菌肉，迅速接入培养基斜面的中部，塞好棉塞，在 25下培养 3-5 天后即可看到组织块周围长出白色稀疏纤细的菌丝，15-18 天菌丝即可长满试管，挑选菌丝健旺无污染的菌管再进行转接扩繁，须经出菇试验合格后用于生产。 孢子分离 这种方法为有性繁殖，所获菌种已经发生遗传重组等变异，生产性状有可能优于母体，也有可能劣于母体。孢子分 离有单孢分离和多孢分离两种方法，单孢分离主要用于遗传育种研究，多孢分离多用于生产繁种。孢子分离技术如下：钩悬收集法 采取成熟的子实体(刚弹射孢子)菌盖块,在无菌室经消毒处理后，将菌褶（伞菌）或菌孔（多孔菌）朝下悬吊于无菌容器内收集孢子，在 22-26下让其自然弹射孢子 5-10 小时，容器底部出现白色孢子印。取无菌水，粘取少量孢子制成孢子悬浮液，用灭过菌的注射器或滴管吸取孢子悬浮液，滴 1-2 滴于试管斜面上，经25培养至孢子萌发，挑选无污染的斜面进行扩繁，经严格的出菇试验，择优用于生产。试管收集法：试管斜面收集孢子，在无菌条件下取一小块子实体组织，蘸少量无菌琼脂或浆糊，粘附于试管培养基斜面的对面玻壁上，加棉塞后在 20左右静置，菌孔组织中的孢子会弹射到斜面培养基上，再去掉试管壁上的菌块，经进一步培养获得多孢子萌发的菌丝体。二、母种制作在食药用菌菌种生产中，菌种制作通常分为二级，即母种和原种。母种也叫一级种，由于菌丝生长在试管的斜面上，所以又称为试管种或斜面种。为了保证质量，防止退化，母种的转接扩管不超过 3 次，转扩次数增多，产量有下降的趋势。对长期保藏的菌株，复壮后须经出菇（耳）试验，方可用于大规模生产或销售。一般生产者都是引进母种，经扩繁后用于制备原种。 母种培养基配方 母种培养基常用琼脂做凝固剂，其又名洋菜或冻粉，从海藻石花菜或其他红藻中提取加工而成，为透明、无味、粉条或粉末状。琼脂的主要化学成分是多聚半乳糖的硫酸脂，包括 D-葡萄糖醛酸、L-半乳糖、D-半乳糖、3,6-脱水-L-半乳糖和丙酮酸等。干琼脂一般含水 16%，灰分 4.4%，氧化钙 1.15%，氧化镁 0.77%，氮 0.4%。琼脂化学结构稳定，不易被菌丝分解利用，在培养基中仅起凝固剂的作用，其在 96时融化成液体，冷却到 45以下即重新凝固。由于用琼脂配制的固体培养基清晰透明，便于观察菌丝的形态，故成为常规斜面域平板培养基不可缺少的材料。其用量因使用季节、目的和琼脂本身质量的不同而异。一般在冬天加1.5%1.8%，夏天为 2%;分离菌种时加 2.5%，生产时加 1.5%2%。用量过多，培养基较硬，保水性好，不易干燥，但成本高。须指出，即使是最纯品的琼脂，也仍然会含有微量的含氮化合物及残存无机盐，因此在进行营养要求精确的实验中，最好不用琼脂。对于生产而言，要求培养基营养丰富，菌丝健旺，因此采用各种加富培养基。常用的母种培养基如下1.马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基(PDA)：去皮马铃薯 200 克，葡萄糖 20 克，琼脂 20 克，水 1000 毫升。这种培养基养分较少，菌丝不会徒长，常用于菌种分离、提纯及转管保存菌种。2.去皮马铃薯 200 克，葡萄糖 20 克，磷酸二氢钾 2.5 克，硫酸镁 0.5 克，蛋白胨 3 克，维生素 B120 毫克，琼脂 20 克，水 1000 毫升。3.去皮马铃薯 200 克，葡萄糖 20 克，磷酸二氢钾 2 克，硫酸镁0.5 克，琼脂 20 克，柞木屑 100 克，水 1000 毫升。4.高梁粉 50 克，葡萄糖 10 克，磷酸二氢钾 2 克，硫酸镁 0.5克，琼脂 20 克，水 1000 毫升。5.平菇 200 克，葡萄糖 20 克，磷酸二氢钾 2.5 克，硫酸镁 0.5 克，蛋白胨 3 克，琼脂 20 克，水 1000 毫升。 试管斜面的制备 1.配制培养基 选择优质马铃薯，去皮(挖去芽眼),切成薄片，称取 200 克，加水 1000 毫升放入小铝锅内煮沸 20-30 分钟，趁热用3 层纱布过滤后取滤液,并用热水补充到 1000 毫升，倒回小铝锅内。加琼脂继续加热，并用玻璃棒搅拌至琼脂全部溶化后，加葡萄糖，再补水至 1000 毫升。2.分装试管 母种培养基一般用试管为容器，常用的规格为 2 种18 毫米18 毫米及 20 毫米20 毫米，培养基装量为 10-15 毫升，为试管长度的 1/4-1/5，培养基不可沾附试管内壁，如有沾附物必须擦试干净。3.做棉塞 取适量棉花制作棉塞，棉塞要做的圆滑硬实，棉塞总长 3-4 厘米。标准的棉塞应是塞头较大，不易变形，入管的部分占塞总长的 2/3，露在管外的部分则为 1/3(不少于 l 厘米) 。棉塞的大小、松紧要与试管口配套，塞入试管的棉塞要紧贴管壁，不留缝隙。过紧妨碍空气流通，也不便操作;过松则达不到滤菌目的，且棉塞易掉入或脱离试管。松紧度以提起棉塞而试管不脱落，拨出棉塞有轻微的声音为适宜。 4.灭菌 将 6-8 支试管捆成 1 把，上面用牛皮纸或双层报纸包住，用皮筋或线绳扎紧，以防棉塞受潮。直立放在高压锅内灭菌。加热灭菌时，排尽锅内冷气，当温度升到 121(压力 1.0 千克/平方厘米)时，维持 30-40 分钟后停止加热，待指针回到零点，先打开锅盖的 1/5，利用余热烘干棉塞，等到无直冲蒸汽时，再打开锅盖，取出试管。5.摆斜面 趁热将试管一端垫放到木条上，使其成一定角度的斜面，一般斜面长度达试管全长的 1/2 为宜。气温低时，覆盖保温，以防冷凝水过多，待完全凝固后，收取备用。6.灭菌效果检查 随机抽取 5 支试管，在 25下进行空白培养3-5 天后，检查斜面上有无杂菌，如果发现有杂菌，说明灭菌不彻底，要废弃或重新灭菌，无杂菌出现即可供接种用。 接种与培养l.灭菌 接种前先将接种用具、培养基以及菌种等放到接种箱(或接种室)内，然后按每立方米用高锰酸钾 5 克，40%甲醛溶液 10毫升的量进行熏蒸消毒 30 分钟，如有紫外线灭菌灯，同时开启照射30 分钟后进行接种。2.接种 接种时试管口不要离开酒精灯火焰旁的无菌区，灼烧一下接种钩并待其冷却，将斜面上的菌苔纵横划切成米粒大的小块，深度以稍带培养基为适，然后再取种块迅速放到待接试管斜面的中心位置，抽出接种钩后，再把试管口烘烧一下，棉塞过火后迅速塞好。如此反复接种，一般每支母种可转接 30-50 支试管。 3.培养 将接种后的试管放入 25的培养箱或培养室进行恒温培养，灰树花需要 12-15 天的培养，菌丝才能长满试管斜面。在培养过程中要随时检查，挑除有杂菌感染或有异常现象的试管，以保证母种的质量。三、原种制作原种是将母种转接于装有培养料的菌种瓶或袋中进行扩大培养的菌种(二级种)。原种制备程序如下： 配方与拌料1. 阔叶树的木屑 78%，麸皮 20%，红糖(或白糖)1%，石膏 1%。含水量在 60%左右，PH 值 5.5-6.5。2. 棉籽壳 90%，麸皮 8%，红糖 1%，石膏 1%。含水量在 60%左右，PH 值 5.5-6.5。3. 棉籽壳 42%，木屑 40%，麸皮 16%，红糖 1%，石膏 1%。含水量在 60%左右，PH 值 5.5-6.5。4. 麦粒 99%，石膏 1%。麦粒用 1%石灰水浸泡 12-24 小时(因气温而定)，加热煮沸 15 分钟，以麦粒不开花为适，然后捞出麦粒稍微晾干，拌入石膏立即装专用菌种瓶或输液瓶，每瓶装湿麦粒 300克，瓶肩处装一薄层棉籽壳封口料，以减少杂菌污染。在配料过程中，要注意以下几点: 锯木屑要过 2-3 目筛，除掉木块、木条、木片、霉料团等硬物，按照生产计划配料，用机器或人工充分拌匀，将红糖溶于水中，随水均匀拌入料内。要做到主、辅料均匀，干湿均匀，酸碱度适宜，无生料团。搞好环境卫生，拌料的场地最好是水泥地，要提前用水冲刷干净，尽量减少污染。灵活掌握含水量，对干料、细料加水宜多一些;对湿料、粗料加水宜少一些。在水泥场地拌料加水宜少一些，以干泥渗水场地拌料，加水宜多一些，具体加水量以拌好料堆闷半小时后，用手紧握料有水从指缝渗出、但不成滴下落即可。操作要快速 在气温高时(28左右)，如拌料至灭菌时间过长，则料易变酸。轻者影响发菌，重则不发菌。因此，要合理安排好生产量，保证在高温期从拌料到灭菌不超过 4 小时，在低温期从拌料至灭菌不要过夜。 装瓶与封口 所用菌种瓶要提前刷洗干净，控干后备用。木屑或棉籽壳培养料装瓶，装料至瓶颈可用木棒压实、压平，料面须在瓶肩以下。然后要在料中间扎直径为 1.5-2 厘米的孔，将瓶口内外壁擦净。取一块完整、略大于掌心的棉絮卷成棉塞，棉塞要比瓶口略粗，稍用力即可旋入瓶口为宜。塞入瓶口 2/3、外露 l/3，棉塞头部与瓶颈的底口平，要松紧适度。过紧，影响通气，发菌慢。过松不但棉塞易脱落，且起不到过滤杂菌的目的，引起杂菌感染。塞好棉塞后，盖上牛皮纸或双层报纸，用皮筋扎紧。 灭菌 采用高压灭菌或常压灭菌。高压灭菌的压力通常为1.5-2 千克/平方厘米，灭菌时间为 2-2.5 小时。常压灭菌需 8-10小时。 接种 接种前必须使瓶温降至 30左右，防止高温接种热死菌种。有冷却室的在冷却室冷却，没有冷却室的可直接在接种室冷却。每支母种可转接 3-4 瓶原种。接种前，首先把接种室(箱)打扫干净，喷 2%来苏尔或新洁尔灭净化空气，再把已灭菌的菌种瓶及用具全部搬进去，然后按常规对接种室(箱)进行严格消毒。接种需严格按照无菌操作进行。具体操作方法是 接种者手持母种试管，用酒精棉球将试管擦2 次，然后拔开棉塞，试管口对准酒精灯火焰上方，用火焰烧一下管口，把烧过的接种耙迅速插入种管内贴玻壁冷却，将斜面前端 1厘米长的菌丝块挖去，剩余的斜面分成 3-4 段，另一个人在酒精灯火焰上方，在接种者取好菌种块的同时拔开原种瓶棉塞，接种者将菌种块取出，快速接入原种瓶的接种穴内，棉塞过火焰后塞好。如此一支试管可接 3-4 瓶原种。每接完一支试管，接种耙要重新消毒，防止交叉感染。接完种后，立即将台面收拾干净，将各种残物如试管、洒落的培养基、消毒用过的棉花等均清出室外，照前述方法进行第二轮接种。 培养 原种培养须注意如下事项：1. 提前几天打扫培养室，对水泥墙壁、地面要进行清洗，并严格消毒处理后方可使用。培养室要求保持空气干燥、清洁、避强光，留有能启闭的通风口，空气流通无死角。2. 将接种后的原种瓶搬入培养室，保持温度在 25左右，保持空气湿度 55-65%。一般 3-5 天菌丝即可吃料，7-10 天菌丝即可封面。待菌丝封面后，加强通风换气，保持室内空气新鲜，一般培养25-85 天菌丝即可长满瓶。3. 培养期间要随时检查，发现污染杂菌应及时采取措施。原种瓶内杂菌滋生部位不同，其污染原因亦不同:如棉塞受潮，空气湿度过大，瓶口部位易滋生红色链孢霉。如瓶内上下均发生绿霉及毛霉等杂菌，则可能是灭菌不彻底。如随机发现接种块四周发生杂菌，则可能是接种操作不熟练或棉塞过松所致。如紧邻几瓶的种块全部滋生杂菌，可能是母种带杂菌或接种工具