番茄黑斑病病原菌的鉴定及生物学特性研究番茄黑斑病是番茄常见的病害之一，此病是由半知菌亚门番茄链格孢真菌Alternaria tomato Weber侵染引起的，链格孢菌是茄科植物中危害较大的病害之一。该病不仅发生在田间，更是采后贮藏过程中的重要病害，可侵染番茄、茄子、辣椒、马铃薯等茄科类蔬菜，主要通过气孔、皮孔、伤口或表皮侵入果实，在适宜的条件下产生大量孢子，对果实造成严重危害1。 研究表明，链格孢菌所产生的选择性毒素对植物有致病性，对人体健康也有一定的影响1，所以研究链格孢菌的生长特性，探究链格孢菌在不同温度、pH 值、光照、碳源和氮源下的菌落长势、直径、菌丝生长速率、菌丝干质量、产孢量的变化，可以探明链格孢菌在不同条件下的生长趋势。 1 材料与方法 试验材料 PDA 固体培养基：200 g 马铃薯， 20 g 琼脂，20 g 葡萄糖，加水补足 1 000 mL。PCA 固体培养基：g 胰蛋白胨，酵母浸粉， g 葡萄糖，20 g 琼脂，pH 值为 7，加水补足 1 000 mL。胡萝卜固体培养基：将胡萝卜去皮后称取 200 g，20 g 琼脂，加水补足 1 000 mL。番茄果肉固体培养基：200 g 番茄，20 g 琼脂，加水补足 1 000 mL。V8 果汁固体培养基：罐装 V8 果汁 200 mL，20 g 琼脂，加水补足 1 000 mL。查彼固体培养基：g NaNO3，1 g K2HPO4， KCl， MgSO4， g FeSO4，30 g 蔗糖，20 g 琼脂，加水补足 1 000 mL。 试验方法 病原菌的分离 根据方仲达的方法2，对番茄发病处病原菌进行分离，采用单孢子分离法获得纯化菌株，在 PDA 培养基上培养后保存备用。生物学特性研究以所获得的纯化菌株tomato 为供试菌株。 病原菌形态学鉴定 将供试菌株在 PDA 培养基上活化，2恒温培养 d后，用无菌水制成一定浓度的孢子悬液，同时观察菌落颜色、大小、形状及分生孢子的形态和颜色，从而进行病原菌的鉴定。 生物学特性的研究 温度对菌丝生长和孢子萌发的影响3 用打孔器将菌体转移至 PDA 培养基上，分别置于1、4、15、25、28、30、37、40 的培养箱内，黑暗条件下培养 d，用十字交叉法测量菌落的直径，采用小室培养法，将孢子悬液滴于凹玻片上，置于以上条件下培养 3、6、1h后，分别检查孢子萌发率。使用棉蓝乳酚油固定孢子悬液，镜检 200 个孢子，记下萌发的孢子数量，计算萌发率。每个处理 3 次重复。值对菌丝生长和孢子萌发的影响 用 1 mol/L 的 HCl 和 NaOH 调节 PDA 培养基的 pH值和孢子悬液的 pH 值为 312。分别置于 2恒温、黑暗条件下和小室恒温培养，观察菌落直径，计算孢子萌发率。光照条件对菌丝生长和孢子萌发的影响 将接入菌块的 PDA 培养基和孢子悬浮液，分别在光暗周期为 1h1h、完全光照和完全黑暗 3 种处理条件下，于 2恒温培养。观察菌落直径，计算孢子萌发率。 不同培养基对菌株生长的影响 分别以 PDA、PCA、番茄果肉固体培养基、V8 果汁固体培养基和胡萝卜固体培养基用打孔器将菌体转移至固体培养基中心位置，置于 2下恒温培养 d，用十字交叉法测量菌落的直径。每个样品 3 次重复，计算平均值。 不同碳源和氮源对菌丝生长和孢子萌发的影响4 选取 D-木糖、D- 果糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖等量替换查彼培养基中的碳源，使得各个不同碳源培养基中碳的含量相同；用不加碳源的培养基作为对照。 选取 L-谷氨酸、天冬酰胺、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏等量替換查彼培养基中的氮源，使得各个不同碳源培养基中氮的含量相同；用不加氮源的培养基作为对照。 将菌块转接到 PDA 固体平板中央，放置在 2恒温培养箱内培养，3、d 后用十字交叉法测量菌落的直径，对照平行组计算出平均数，每组试验重复 3 次。 光照对菌株生长和孢子萌发的影响 将菌块转接到 PDA 固体培养基内，分别在光暗周期为 1h1h、完全光照和完全黑暗 3 种处理条件下，2恒温培养箱内培养；3、d 后测量菌落的直径，对照平行组计算出平均数，每组试验重复 3 次。 将制备好的孢子悬浮液滴于凹玻片上，分别在光暗周期为 1h1h、完全光照和完全黑暗 3 种处理条件下，2 联盟的恒温培养箱内培养，6、1h 后测定孢子萌发率。 致死温度的确定 吸取 1 mL 孢子悬液至无菌试管中，分别置于406的恒温水浴锅中处理 520 min 后迅速冷却。将处理后的孢子悬液滴于凹玻片上，2小室培养，1h 后观察孢子萌发情况，测定孢子萌发率。2 结果与分析 分离菌株的形态学观察 分离纯化后获得 5 株菌株，分别编号为tomato、tomato、tomato、tomato、tomato，将这些菌株培养 d 即可长满整个培养皿，该菌的基本形态特征为：在 PDA培养基上，菌落较为致密，呈絮状平铺生长，菌落最外层为灰白色，边缘整齐，向内为墨绿色，有较清晰的轮纹；分生孢子梗分隔，有横纵隔膜，其中横膈膜 15 个，纵隔膜 03 个，呈棕黄色，常多个呈链状分布；单孢子短卵、椭圆或倒棍棒形。根据该菌株的培养形状及形态学特征，根据相关资料5-10 ，依据真菌鉴定手册的相关描述11，初步鉴定为链格孢菌Alternaria alternate Kiessler。 生物学特性 温度对菌株生长和孢子萌发的影响 由图 2 可知，在 4、15、25、28、30、3中均可生长，其中 2为最佳生长温度，培养 3、d 后菌落平均直径达到了 30、50 mm，菌落生长速度快，菌丝浓厚茂密，颜色呈黑色，菌落边缘整齐。当温度小于 1或大于 3时，菌落生长明显受到抑制，菌丝变成灰白色，黑色孢子变少，菌落边缘分辨不清，菌株有老化迹象；培养 d 后菌落直径均小于 30 mm。当温度为 1、40 时菌株不生长，也无萌发迹象。黑色链格孢分生孢子在 43范围内均可萌发，其中下培养 h 萌发率最低，为%；2下培养 1h 萌发率最高，为%。当培养温度小于 1或大于 3时，分生孢子萌发率明显降低，培养 1h 萌发率均低于%；当温度小于或大于 3时，分生孢子则不能萌发。 值对菌株生长和孢子萌发的影响12 由图 3 可以看出，番茄黑色链格孢菌在 pH 值为312 的 PDA 固体平板培养基中均可生长，当 pH 值为 6时，菌落生长速度最快；当 pH 值小于 4 或大于 9 时，菌株生长明显受到抑制。pH 值为 310 时，培养 1h 后平均有%的病原菌孢子可以萌发；pH 值为 7 时，病原菌孢子萌发率最高，培养 1h 后萌发率为%；当 pH 值大于 11 时，孢子不能萌发。综合考虑，菌丝生长和孢子萌发的最适 pH 值选为6。 光照条件对菌株生长和孢子萌发的影响 不同碳源和氮源对菌株生长和孢子萌发的影响 由图 4 可以看出，致病菌在 D-木糖、D-果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖等 7 种不同碳源查彼固体平板培养基中均可正常生长，2培养 d 后，菌落平均直径在 mm 之间；培养 d 后差异明显，菌落平均直径在 mm 之间。在供试的 7 种不同碳源培养基中，D-木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖菌落平均生长直径优于其他培养基；其中，菌落生长状况最佳的为添加乳糖的查彼固体平板培养基，2中培养 d 后，菌落平均生长直径达到 mm，菌落生长速度快，菌丝浓厚茂密，颜色呈黑色，菌落边缘整齐；不加碳源的对照组则不生长。 试验结果表明，菌株在 NaNO3、天冬酰胺、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-谷氨酸等 6 种不同氮源查彼固体平板培养基中均可正常生长，2培养 d 后，菌落平均直径在2500 mm 之间；培养 d 后差异明显，菌落平均直径在 mm 之间。在供试的 6 种不同碳源培养基中，NaNO3 、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏菌落平均生长直径优于其他 2 种培养基；其中菌落生长状况最佳的为添加酵母膏的查彼固体平板培养基，2中培养 d 后，菌落平均生长直径达到 mm，菌落生长速度快，菌丝浓厚茂密，颜色呈黑色，菌落边缘整齐；天冬酰胺则会抑制病原菌生长，2培养 d 后，菌落平均直径低于 mm；不加氮源的对照组则没有生长。 致死温度的确定 试验结果得出，供试菌株分生孢子在 404处理520 min 均可正常萌发；50 处理 20 min 时萌发率明显降低，培养 1h 后平均萌发率只有 11%，且菌丝生长受到影响；6处理 1min 后平均萌发率较 50 处理 20 min 后更低，培养 1h 后平均萌发率只有 3%；6处理CM 试菌株的致死温度为 6处理 20 min，菌株有耐高温属性。 3 讨论与结论 重点对番茄链格孢菌的生长特性进行研究，结果显示，此菌对 PDA 固体平板培养基中的营养物质利用率较高，生长速度较快。致死温度为 6处理 20 min；菌株生长和孢子萌发的最适温度为 2；全黑暗培养下菌落生长速度最快，全黑暗下孢子萌发率最高。根据以上结论可知，此菌株生长特性与正常环境温度、光照条件相似，所以可以在很短的时间内侵染萌发、生长扩展，与其耐高温、不喜光、营养选择上的特性相同。 该菌株喜好偏酸至中性的生长条件，与果肉和果实本身的 pH 值相近，与报道已知的病原菌一样，菌株与寄主之间是相互作用的，这种特性有利于菌株本身的生长发育13-15，推论其自身代谢物也有可能会对寄主本身的酸碱值造成一定的改变。 番茄链格孢菌对碳源、氮源的选择不苛刻，常见碳氮源均可使其正常生长，没有规律性可言。对于碳源的选择上，菌株在等量替换成乳糖的查彼固体平板培养基上菌落生长最快，蔗糖次之。在氮源的选择上，菌株在等量替换成酵母膏的查彼固体平板培养基上生长最佳；天冬酰胺则有一定的抑制作用。