马铃薯低温糖化的机理及其改良策略2010-03-06 9:44张 迟，柳 俊，谢从华，宋波涛，成善汉，朱青(1华中农业大学园艺林学学院，湖北武汉 430070；2华中农业大学生命科学技术学院) 摘 要：低温贮藏引起的糖化是影响马铃薯油炸加工品质的重要因素，其糖化机理涉及到一系列酶调控的淀粉耪代谢途径，同时亦与细胞渗透调节机制有关。低温耪化的改良目前主要集中在淀粉糖代谢的生化途径上，包括提高淀粉合成相关酶活性及抑制淀粉和蔗糖降解。关键词：低温糖化；加工品质；品质改良马铃薯作为典型的淀粉作物，不仅是主要的粮食作物，同时亦是重要的工业原料作物。在西方国家，马铃薯淀粉被广泛应用于食品、纺织及造纸等加工业 Etl。在马铃薯食品加工业中，油炸食品是其主要的部分，大约占马铃薯加工食品的 70以上。为了实现周年供应，同时为了减少采后病虫害、薯块萌发等带来的损失，用于加工的马铃薯通常需要储藏在 4左右的低温环境中，从而带来了一个严重的负面影响一块茎还原糖含量的上升，淀粉含量的下降.与块茎萌发时淀粉降解不同，低温贮藏中还原糖累积的区域不只局限于芽眼周围，而是扩大到整个储藏器官，这种现象被称之为低温糖化，其后果是在油炸加工过程中，马铃薯中的还原糖与食用油中的游离氨基酸发生化学反应而产生一种褐色并略带苦味的物质，这即是所谓的 Maillard 反应。这一反应严重影响了马铃薯油炸制品的外观品质和食用品质 2，这是长期以来困扰加工业的一大难题。关于低温糖化的机理已有大量的研究，结果显示，淀粉糖代谢过程中的几个关键酶参与了低温糖化的过程 3，4 ，为从根本上解决这一难题奠定了基础。然而，常规的育种途径通常在降低还原糖的同时，亦使淀粉含量随之下降，从而很难获得淀粉含量符合加工要求，同时又抗低温糖化的品种。近年来，随着分子生物学技术在育种上的应用，利用分子技术，改良低温特定条件下淀粉代谢途径，有可能获得加工性状优良的品种。低温糖化的生化机理酶调节作用.蔗糖降解为己糖是植物碳源利用的重要途径。研究表明，进入马铃薯块茎的蔗糖可以通过外质体中的转化酶(Invertase)或细胞质中的转化酶直接降解为己糖，或通过细胞质中的蔗糖合成酶(Sucrose synthase)催化蔗糖与尿苷磷酸(UDP)生成尿苷二磷 酸葡萄糖(UDPglucose)和果糖 5。通常，在块茎形成的早期，块茎内转化酶的活性较高，而块茎发育过程中，则蔗糖合成酶的作用占主导地位 6。 转化酶，又称蔗糖转化酶，能水解蔗糖为葡萄糖和果糖，是蔗糖降解的关键酶之一。按其生化特性和亚细胞定位，转化酶大致可分为两种类型：酸性转化酶，其作用的最适 pH 值为 4.55.0，主要分布于液泡和细胞壁中；弱碱性转化酶，最适 pH 为 6.88.0，主要定位于细胞质中。有研究表明，酸性转化酶的活性与己糖蔗糖的比值呈较高的相关性 7，本实验室的研究结果显示，低温储藏中，酸性转化酶与还原糖含量的相关系数R 达到 079(未发表)，并且，只有 UGPase 和 Invertase 的活性受到低温的影响。酸性转化酶活性受重金属离子(Ag 十、Hg 十)以及自身产物的抑制，但能够为机械损伤、糖、病原菌等所激活 8。在所有分离的酸性转化酶 cDNA 序列中，均含有 ND-PNG(在马铃薯中为 NDPNA)和 WEPDC 两个保守位点 9。进一步分析证明，马铃薯酸性转化酶基因组包括 6 个 exon，保守位点 NDPNA 中的 DPN 刚好组成 exon2，能够为低温所诱导而被选择性剪切，当温度上升时又可恢复，因而推测该区域可能是酸性转化酶对低温诱导信号应答的位点，从而使得在低温时，块茎中酸性转化酶大量转录 10 加速了蔗糖降解，促使低温糖化。 酸性转化酶还存在一个蛋白质调节因子一转化酶抑制子。在从烟草悬浮系中纯化细胞壁转化酶的过程中，分离得到了17KD 的 pH 依赖性的多肽 11。由于与转化酶共同定位于细胞壁，因而推测该蛋白质可能对转化酶活性起到重要的生理调节作用。利用一个与烟草细胞壁转化酶同源的液泡转化酶抑制子转化马铃薯，在 35S 组成型启动子的控制下，使其超量表达，结果使转基因马铃薯系的块茎在低温贮藏中己糖积累下降了 75,并且该转基因株系的块茎产量、淀粉质量和数量与原品种没有显著的差异 12。目前,酸性转化酶抑制子的序列，在烟草、番茄；拟南芥等植物中都已有报道(Y12806、 Y12805、AJ010943、Y12807、AF529166)。马铃薯转化酶抑制子早在 1967 年即有报道 13，Genebank 检索显示，近年来也有一些关于该抑制子的核酸序列的报道(AF459077AF459083)，但均未做功能鉴定。序列比较的结果显示，转化酶抑制于基因特别是液泡转化酶抑制子基因在不同作物间同源性较低，这给马铃薯直接克隆该基因带来一定困难，因此目前还没有直接从马铃薯中克隆出有抑制功能的该基因的报道。我们采用本实验室建立的改良试验技术，在已报道的该抑制子氨基酸序列基础上设计克隆方案，有望在近期内获得马铃薯酸性转化酶抑制子基因用于低温糖化性状的改良.腺苦二磷酸焦磷酸化酶(AGPase)是淀粉合成中的一个关键酶 14。AGPase 以 l磷酸葡萄糖(GlP)为底物，在 ATP 的催化下，生成 ADP葡萄糖(ADP。Glc)并释放出焦磷酸(PPi)。马铃薯块茎中的AGPase 由大、小两个亚基组成，小亚基分子量 50KD，具有 G1P 底物结合位点，起到主要的催化功能，而大亚基则起到调节小亚基催化功能敏感性的作用 15，存在变构调节，受到 Pi 的抑制和 3PGA 的激活 16。利用反 RNA 技术抑制 AGPase 的活性，可达到几乎完全抑制淀粉生物合成的效果 17。但外源转化 AGPase 基因，其结果在不同研究间却有不同。大肠杆菌 AGPase 基因 glgc16 转化体系中，Stark 等 18得到了淀粉含量增加 30的再生植株，而 Sweetlove 等 15却几乎没有检测到块茎中淀粉含量的明显变化。在随后的U14C 同位素示踪实验中，他们观察到进人块茎淀粉合成的蔗糖流量不断增加，但淀粉的转换也有相应的增强。由此，他们提出在反应体系中，增强具有最大正向催化功能的酶表达的同时，也可能启动编码反向催化功能的酶的基因表达，从而抵消了前面的增强效果，故认为 AGPase 在淀粉生物合成中的作用也可能受到反馈抑制 19。所以，通过 AGPase 的途径改良马铃薯低温糖化可能还需同时考虑其它相关代谢途径中酶的作用，才能实现整个淀粉糖代谢过程的协调。本实验室正通过外源转化 AGPase 小亚基基因，获得一系列转化子，进一步研究提高 AGPase 酶活性以后，其它相关酶的变化和对块茎低温糖化的影响，力求在明确相关酶协调作用机理的基础上，达到改良马铃薯低温糖化性状的目的。12 淀粉性质的影响与大多数淀粉作物相似，马铃薯淀粉亦包括直链和支链淀粉，其中支链淀粉占 7282，构成马铃薯淀粉粒中的无定形液晶部分，而直链淀粉则组成结晶区域，液晶部分是酶解的敏感区域 20，21 ，它的高度分支阻碍了分子内和分子问的氢键形成，使淀粉粒结构不稳定。易“淀粉糖化”的品种 22，其淀粉粒结构中，直支链淀粉比值小，光镜与电镜的观察结果显示，该品种淀粉粒被酶大量分解 23。表明马铃薯淀粉糖化与其淀粉粒分子结构和淀粉性质有关。马铃薯中与淀粉粒形成和淀粉性质有关的酶基因已有一些研究，如 GBSS I(Granulebound starch synthase)，三种可溶性淀粉合成酶(Soluble starch synthase)和二种 SBE(Starch branching synthase)已克隆并进行了功能分析 24，25 。这些酶的调控研究大多集中在改良淀粉性质领域，但通过调控这些酶基因的表达目前并未获得抗低温糖化的材料。然而，Ruth Lorberth等 2在对一种淀粉颗粒结合蛋白(R1)进行功能鉴定研究显示，Rl 蛋白与淀粉的磷酸化程度有关。反义抑制R1 基因表达，可导致马铃薯中淀粉磷酸化程度降低，淀粉粘性特点的改变，转基因马铃薯块茎低温贮藏后淀粉降解程度减少，还原糖含量的大幅下降。因而，他们提出减少 Rl 蛋白，能够使淀粉更加不易被降解，从而为解决低温糖化提出了一条新的途径。13 焦磷酸调节作用焦磷酸是块茎淀粉代谢过程中重要的协同因子。一分子蔗糖经蔗糖合成酶水解的过程中，需水解一分子焦磷酸提供能量 t53，在淀粉的生物合成中，通过叶绿体膜上的焦磷酸转运体 26，或由包括 6磷酸果糖焦磷酸。l磷酸转移酶 Prophosphatefructose6phosphate-1-phosphatransferase，PFP)或液泡膜焦磷酸酶 27在内的循环过程实现焦磷酸的循环利用。焦磷酸水平的高低将细胞质中的合成反应和质体中的分解反应有机协调，从而在蔗糖淀粉的转换中起到重要的调节作用 5。在一种细菌焦磷酸酶高效表达的体系中，焦磷酸水平的下降，使成熟块茎中蔗糖的降解以及淀粉的积累都受到抑制 28，但在生长中的块茎内，却表现出几乎相反的结果，蔗糖合成酶和 AGPase 的活性均被激活，从而使促进了蔗糖的降解和淀粉的合成 E29I。低水平的焦磷酸，对马铃薯块茎的萌发也表现出一些截然相反的结果 30,31。Ferre 等27在 AGPase 和 Invertase 活性被抑制的转基因体系中，对蔗糖降解和淀粉合成中的磷酸含量进行测定，结果显示，焦磷酸产生的主要部位在正在成熟的块茎中，这一反应是由 AGPase 催化完成的，并且，对淀粉糖代谢过程中的焦磷酸水平变化的数据进行分析，其结果与焦磷酸在质体中产生的假说相一致，认为质体中产生的焦磷酸是为细胞质中蔗糖合成酶所催化的蔗糖降解途径提供能量，焦磷酸是联系马铃薯块茎细胞质和质体中蔗糖降解、淀粉合成以及淀粉贮藏器官中糖酵解代谢的纽带。焦磷酸水平的上升，可能会阻碍质体的转运过程 3234，使得增加的 G1P 和 ATP 不能在造粉体中得到反馈 27，或导致质体中无机磷酸的积累，从而反过来，对 AGPase 产生直接或间接的抑制 35，或者说质体中的焦磷酸浓度的增加将直接影响 AGPase 所催化的反应的发生频率。14 糖异生途径的影响糖酵解反应的抑制也是低温糖化现象产生的一个方面。PFP、磷酸果糖激酶(Phosphate-fructosekinase，PFK)的一种分子量形式 PFK236和依赖 ATP 的丙酮酸激酶(pyruvate kinase)是这一过程中的关键酶。低温条件下，这些酶的活性降低 37，阻止 G1P 进入糖酵解，而使其进入糖异生途径。使 UDP 葡萄糖焦磷酸化酶作用生成的 UDPG 与 6磷酸果糖形成 6磷酸蔗糖，再经去磷酸化形成蔗糖，在转化酶作用下生成葡萄糖和果糖，从而导致马铃薯块茎中还原糖含量增加。2 细胞生理学机制马铃薯低温糖化的细胞生理学原因，亦是人们研究的重要领域之一。在众多的研究中，Sowokinos 提出的渗透调节假说(Leaky membrane theory) 38得到了大多数人的支持。他认为还原糖含量的上升应归因于液泡膜的渗漏，并进一步导致在大量无机离子积累的细胞质环境中，一系列酶的活性的改变。低温下细胞电导率的测定结果表明 39，低温破坏了细胞膜的渗透性，块茎中糖浓度随着电导率的上升而增加，因而电导率的测定是评定液泡膜渗漏程度的一个很好的标志。对细胞膜的完整性产生影响的因素主要有：膜的不饱和程度，膜脂的过氧化反应等，特别是过氧化反应中产生的自由基，对膜脂、膜的透性、与膜结合的酶的破坏性较大。研究表明，耐低温糖化的品种中与膜稳定性有关的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶的活性均较高 40。3 控制低温糖化的