免疫组化操作步骤（一）、仪器设备1. 18cm 不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试 剂1. PBS 缓冲液（ph7.27.4）：NaC137mmol/L，KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L.20.01mol/L 柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g。30.5mol/L EDTA 缓冲液（ph8.0）：700ml 水中溶解 186.1g EDTA2H2O,用 10mmol/L NaOH 调至 ph8.0,加水至 1000ml.4. 1mol/L 的 TBS 缓冲液（ph8.0）：在 800ml 水中溶解 121gTris 碱，用 1N 的 HCl 调至 ph8.0, 加水 1000ml。5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用 0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液： 用 0.1N 的 HCl 配制。6. 3%甲醇H2O2 溶液：用 30%H2O2 和 80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a. 甘油和 0.5mmol/L 碳酸盐缓冲液（ph9.09.5）等量混合 b 油和 TBS(PBS)配制8TBS/PBS PH9.09.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4 适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置 60 分钟或 60恒温箱中烘烤 20 分钟。a 组织芯片置于二甲苯中浸泡 10 分钟,更换二甲苯后在浸泡 10 分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复 在沸水中加入 EDTA(ph8.0)或 0.01m 枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 b 沸热修复 电炉或水浴锅加热 0.01 枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至 95左右，放入组织芯片加热 10-15 分钟。 c 微波炉加热 在微波炉里加热 0.01 枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔 5-10 分钟，反复1-2 次。适用的抗原： Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin. ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等B 酶消化方法 常用 0.1%胰蛋白酶和 0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热 37，消化时间约为 5-30 分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等3、免疫组化染色 SP 法（1） 脱蜡、水化 （2）PBS 洗 2-3 次各 5 分钟 （3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在 TMA 上，室温静置 10 分钟 （4）PBS 洗 2-3 次各 5 分钟 （5）抗原修复（6）PBS 洗 2-3 次各 5 分钟 （7）滴加正常山羊血清封闭液，室温 20 分钟，甩去多余液体（8）滴加 抗 50l,室温静置 1 小时或 4过夜或 371 小时（9）4过夜后需在 37复温 45 分钟（10）PBS 洗 3 次每次 2 分钟（11）滴加抗 45-50l,室温静置或 371 小时（12）抗中可加入 0.05%的 tween-20.（13）PBS 洗 3 次各 5 分钟（14）DAB 显色 5-10 分钟，在显微镜下掌握染色程度 （15）PBS 或自来水冲洗 10 分钟 （16）苏木精复染 2 分钟，盐酸酒精分化（17）自来水冲洗 10-15 分钟 （18）脱水、透明、封片、镜检。4、SABC 法（1） 脱蜡、水化 （2）PBS 洗 2 次各 5 分钟 （3）用蒸馏水或 PBS 配制新鲜的 3%H2O2，室温封闭 5-10 分钟，用蒸馏水洗 3 次（4）抗原修复（5） PBS 洗 5 分钟 （6）滴加正常山羊血清封闭液，室温 20 分钟，甩去多余液体（7）滴加 抗 50l,室温静置 1 小时或 4过夜或 371 小时（8）PBS 洗 3 次各 2 分钟（9）滴加生物素化抗，20-37 20 分钟（10）PBS 洗 3 次各 2 分钟 （11）滴加试剂 SABC 20-30 20 分钟（12） PBS 洗 4 次各 5 分钟 （13） DAB 显色：试剂盒或自配显色剂显色（14）脱水、透明、封片、镜检免疫组化问题解答1、染色过强原因 解决方法a 抗体浓度过高或孵育时间过长 降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温 1 小时或 4 度过夜b 孵育温度过高超过 37 度 一般在室温 20-28 度c DAB 显色时间过长或浓度过高 显色时间不超过 5-12 分钟，以显微镜下观察为准 2、非特异性背景染色原因 解决方法a 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗 3 次每次 5 分钟b 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜 3%H2O2 封闭孵育时间延长c 组织中含内原性生物素 正常非免疫动物血清再封闭d 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间3、染色弱原因 解决方法 a 抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时间不能少 于 60 分钟b 试剂超过有效使用时间 应更换试剂c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释 （应防止切片干燥）d 室温太低 低于 15 度 要改放在 37 度孵育箱孵育 30-60 分钟或 4 度冰箱过夜e 蛋白封闭过度 封闭不要超过 12 分钟4、染色阴性原因 解决方法 a 操作步骤错误 应重试 设阳性对照b 组织中无抗原 设阳性对照以验证试验结果c 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗二抗种属无误 三步法（SP 系列），实验步骤使用说明：SP9001（兔）适用于兔来源的一抗SP9002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗SP9003 （山羊） 适用于山羊来源的一抗SP9000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗3.0ml- 价格 ￥230.00 / 6.0ml- 价格 ￥380.00 / 18ml- 价格 ￥1080.00试剂盒规格及贮存条件规格：3ml（50 片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)贮存条件：本试剂盒宜 4保存，稳定期 1 年一试剂盒内容试剂 1 封闭用非免疫的驴血清工作液（含 10%驴血清） 即用型 试剂 2 生物素化二抗（驴抗兔/鼠/山羊） 即用型 试剂 3 链酶卵白素-碱磷酶轭合物 即用型 试剂 3 过氧化物酶标记链酶卵白素 即用型 实验步骤简介：1. 细胞爬片：冷丙酮或 4%的多聚甲醛固定的细胞爬片，置 0.1mol PBS 室温 10 分钟复水。2. 修复：滴加复合消化液（0.125 胰蛋白酶% +0.1 胃蛋白酶%+0.01 EDTA% ）（ 0.1molPBS 配制）4 度 30-40 分钟 0.1mol PBS 洗三次，每次一分钟3. 血清封闭：（试剂 1）室温 10 分钟，倾去。4. 一抗：37 1 小时或 4 度过夜5. 0.1mol PBS 洗三次-每次三分钟6. 相应的生物素化二抗（试剂 2）37 30-40 分钟7. 0.1mol PBS 洗三次-每次三分钟8. 链酶卵白素-碱磷酶轭合物或过氧化物酶标记链酶卵白素（试剂 3） 37 40 分钟9，NBT/BCIP 或 DAB 显色，切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用 AEC 显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂。灏洋生物 15:14:49名称 ：connexin 43 产品编号 ：CM7269价格/规格：0.1ml/20ug 技术指标 ：小鼠抗人，大鼠，小鼠 单克隆抗体 Ig 分类：IgG2a适用组织 ：冰冻/石蜡 阳性部位：细胞浆 组织处理：0.1mol 枸橼酸缓冲夜-热修复 15 分钟（95 度）产品说明 ：产地: Cellscience二步法（无生物素 PV6000 系列），实验步骤使用说明：试剂盒组成 试剂 A: 3% H2O2 试剂 B: Polymerized HRP-Anti Mouse 或 Rabbit IgG 3.0ml/6.0ml/18ml（根据一抗宿主而定）PV6001（兔）适用于兔来源的一抗PV6002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗PV6000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗3.0ml- 价格 ￥300.00 / 6.0ml- 价格 ￥580.00 / 18ml- 价格 ￥1780.00试剂盒规格及贮存条件规格：3ml（50 片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)贮存条件：本试剂盒宜 4保存，稳定期 1 年免疫组化染色步骤1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用 PBS(pH7.4)冲洗三次，每次 3 分钟（3x3）。2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。3. 如果有必要，每张切片加 1 滴（试剂 A）室温下孵育 10 分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS 冲洗 3x3。4. 除去 PBS 液，每张切片加 1 滴或 50l 的第一抗体(用户自选)，室温下孵育 60 分钟或4过夜，建议参见每种抗体的说明书。5. PBS 冲洗 3x5。除去 PBS 液，每张切片加 1 滴或 50l 酶二抗聚合物(试剂 B)，室温下孵育 40 分钟或 37 度孵育 30 分钟或 4 度过夜。PBS 冲洗 3x3。6. 除去 PBS 液，每张切片加 1 滴或 50l 新鲜配制的 DAB 或 AEC 溶液（详见 DAB 或 AEC 使用说明书），显微镜下观察 3-5 分钟（DAB）或 10 分钟（AEC）。7. 自来水冲洗，苏木素复染，若有必要，可用 0.1%HCl 分化，自来水冲洗，PBS 返蓝。8. 如果用 DAB 显色，则切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用 AEC 显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂。封片。灏洋生物 15:15:15名称 ：connexin 43 产品编号 ：CM7269价格/规格：0.1ml/20ug 技术指标 ：小鼠抗人，大鼠，小鼠 单克隆抗体 Ig 分类：IgG2a适用组织 ：冰冻/石蜡 阳性部位：细胞浆 组织处理：0.1mol 枸橼酸缓冲夜-热修复 15 分钟（95 度）产品说明 ：产地: Cellscience二步法（无生物素 PV6000 系列），实验步骤使用说明：试剂盒组成 试剂 A: 3% H2O2 试剂 B: Polymerized HRP-Anti Mouse 或 Rabbit IgG 3.0ml/6.0ml/18ml（根据一抗宿主而定）PV6001（兔）适用于兔来源的一抗PV6002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗PV6000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗3.0ml- 价格 ￥300.00 / 6.0ml- 价格 ￥580.00 / 18ml- 价格 ￥1780.00试剂盒规格及贮存条件规格：3ml（50