寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)克隆 PCR产物的方法之一，是在 PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。有研究者使用了 15种限制酶，分别比较了各种限制酶在其酶切位点旁边分别加 0、1、2、3 个保护碱基后的切断情况。结果显示，基本上所有限制酶，在其酶切位点旁边加上 3个以上的保护碱基后，可以对其酶切位点进行有效切断。一般来讲，在酶切位点前加入两个 GC碱基，因为如果保护碱基为 AT的话,保护碱基在 PCR产物的末端,AT 之间只有两个氢键,结合力差,容易在末端产生单链,这样的话限制性内切酶就无法作用。其实加保护碱基的多少，是具体情况具体讨论，比如 HindIII、BamHI 等就得有三个保护碱基。少了一个就无法切动。为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB 采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近 DNA末端时也很有用。本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上 6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用 - 32PATP在 T4多聚核苷酸激酶的作用下标记 0.1A260单位的寡核苷酸。取 1 g已标记了的寡核苷酸与 20单位的内切酶，在 20C条件下分别反应 2小时和 20小时。反应缓冲液含 70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的 NaCl或 KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M 尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。切割率%酶 寡核苷酸序列 链长2 hr 20 hrAcc I GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 120 0 00 0 0Afl III CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG8 10 120 90 900 90 90Asc I GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 1290 90 9090 90 90Ava I CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA8 10 1250 90 9090 90 90BamH I CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG8 10 1210 90 9025 90 90Bgl II CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC8 10 120 75 250 90 90BssH II GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 120 0 500 0 90BstE II GGGT(A/T)ACCC 9 0 10BstX I AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT22 24 270 25 250 50 90Cla I CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG8 8 10 120 0 90 500 0 90 50EcoR I GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG8 10 1290 90 9090 90 90Hae III GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA8 10 1290 90 9090 90 90Hind III CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG8 10 120 0 100 0 75Kpn I GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG8 10 120 90 900 90 90Mlu I GACGCGTC CGACGCGTCG8 100 250 50Nco I CCCATGGG CATGCCATGGCATG8 140 500 75Nde I CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC8 10 12 18 20 220 0 0 0 75 750 0 0 0 90 90Nhe I GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG8 10 120 10 100 25 50Not I TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA12 16 20 24 280 10 10 25 250 10 10 90 90Nsi I TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT12 2210 9090 90Pac I TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG8 10 120 0 00 25 90Pme I GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG8 10 12 240 0 0 750 25 50 90Pst I GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT8 14 22 24 260 10 90 90 00 10 90 90 0Pvu I CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA8 10 120 10 00 25 10Sac I CGAGCTCG 8 10 10Sac II GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA8 120 500 90Sal I GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA28 30 320 10 100 50 75Sca I GAGTACTC AAAAGTACTTTT8 1210 7525 75Sma I CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA6 8 10 120 0 10 9010 10 50 90Spe I GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG8 10 12 1410 10 0 090 90 50 50Sph I GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT8 12 140 0 100 25 50Stu I AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT8 10 1290 90 9090 90 90Xba I CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG8 10 12 140 90 75 750 90 90 90Xho I CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG8 10 120 10 100 25 75Xma I CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA8 10 12 140 25 50 900 75 90 90